Journal of Molecular Signaling, 2007; 2: 1-1 (más artículos en esta revista)

ArhGAP9, una novela MAP quinasa de acoplamiento de proteínas, y Erk inhibe la activación de p38 a través de WW dominio vinculante

BioMed Central
K Ang Boon (angbk@bii.a-star.edu.sg) [1], Lim Chun Y (cylim@imcb.a-star.edu.sg) [1], Sharon S Koh (u0203295@nus.edu. sg) [3], Neelamegam Sivakumar (shiva@imcb.a-star.edu.sg) [1], Shahrizan Taib (seri_dewi143@yahoo.com.sg) [1], B Kim Lim (kimbuay@cmm.a- star.edu.sg) [5], Sohail Ahmed (ahmeds@cmm.a-star.edu.sg) [5], Guna Rajagopal (guna@bii.a-star.edu.sg) [2], Siew H Ong (shong@imcb.a-star.edu.sg) [1]
[1] Instituto de biología molecular y celular, 61 Biopolis Drive, Proteos, 138673, Singapur
[2] Instituto de Bioinformática, 30 Biopolis Street, Matrix, 138671, Singapur
[3] Departamento de Microbiología, Yong Loo Lin Facultad de Medicina, 10 médicos Drive, Universidad Nacional de Singapur, 117597, Singapur
[4] Departamento de Fisiología, Yong Loo Lin Facultad de Medicina, 10 médicos Drive, Universidad Nacional de Singapur, 117597, Singapur
[5] Centro de Medicina Molecular, 61 Biopolis Drive, Proteos, 138673, Singapur

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Resumen

Hemos identificado ArhGAP9 humanos como una novela MAP quinasa acoplamiento proteína que interactúa con Erk2 α p38 y complementaria con cargo a través de residuos en el dominio de WW ArhGAP9 y el CD de dominios Erk2 α y p38. Esta interacción secuestra el MAP quinasas en sus estados inactivos a través de desplazamientos de MAP quinasa quinasas dirigidas a los mismos sitios. Mientras que la sobre expresión de tipo salvaje ArhGAP9 MAP quinasa causados por la activación del factor de crecimiento epidérmico receptor (EGFR) a ser suprimida y conservas de las fibras de actina estrés en quiescent Swiss 3T3 fibroblastos, la sobre expresión de un ArhGAP9 mutantes defectuosos en MAP quinasa EGFR vinculante restaurado - MAP quinasa inducida por la activación y dio lugar a importantes perturbaciones de la tensión fibras, en consonancia con la función de activación de Erk en el desmontaje de las fibras de actina estrés. La interacción entre ArhGAP9 y el MAP quinasas representa un nuevo mecanismo de la cooperación transfronteriza, hablar entre Rho GTPase y MAP quinasa señalización.

Fondo

El amplio estudio de los mecanismos moleculares de transducción de señales intracelulares en los dos últimos decenios se han dilucidado las principales vías que son importantes para controlar las funciones celulares y han proporcionado importantes conocimientos en el descubrimiento de medicamentos. Dos de las más estudiadas incluyen los itinerarios Mitogen-proteína activada (MAP) quinasa y la cascada de señalización de los pequeños-GTP vinculante GTPasas de la superfamilia Ras. Estas vías son esenciales en el desarrollo normal y aberrantes funciones se han traducido en una amplia gama de condiciones fisiopatológicas.

El MAP quinasa cascadas desempeñan papeles importantes en una amplia variedad de funciones celulares y son conservadas evolutivamente. En los mamíferos hay cuatro miembros de la subfamilia, a saber, Erk1 / 2, p38, JNK y Erk5. Cada MAP quinasa tiene sus propios activadores, sustratos y inactivators. El MAP quinasa cascada es estrictamente regulados a fin de lograr funciones celulares que son espacial y temporalmente, precisa. Estudios recientes han puesto de manifiesto dos mecanismos que regulan la señalización MAP quinasa, es decir, el acoplamiento y andamios interacciones. MAP quinasas en posesión de un acoplamiento común (CD) de dominio que es localizado en el C-terminal de la región de dominio kinasa para la interacción con las proteínas de acoplamiento incluida la activación de aguas arriba MAP quinasas quinasa quinasas (MAPKKs), MAP quinasas activación de proteínas quinasas (MAPKAPs), MAP quinasa - fosfatasas específicas (MKPs) y MAP quinasa sustratos como Elk [1]. Estas proteínas de acoplamiento de todos los residuos contienen básica en el acople (D) de dominio que forman interacciones electrostáticas con los residuos ácidos en el CD de dominio de las MAP quinasas [1]. Andamios proteínas interactúan con varios componentes de las cascadas de MAP quinasa para ensamblar las enzimas y los sustratos en un mismo complejo para lograr la señalización especificidad [2].

El Rho GTPasas son principalmente implicadas en la regulación del citoesqueleto de actina. La conmutación de Rho GTPasas está perfectamente regulado a través de unión a GTP o el PIB [1, 2]. El genoma humano contiene 22 Rho GTPasas, 80 Rho uanine de nucleótidos G E F actores Xchange (RhoGEF's) que catalizar el intercambio de PIB y alrededor del GTP mismo número de Rho TPase G-A ctivating P roteins (RhoGAP's) que se unen a las proteínas Rho para aumentar sus tasas de hidrólisis de GTP obligado. El RhoGAP de servir como importantes reguladores negativos de señalización Rho [3 - 5].

La abundancia de proteínas Rho y sus reguladores y el descubrimiento de las mutaciones en varios de ellos en las enfermedades humanas de relieve la importancia de Rho GTPase señalización en condiciones normales de desarrollo y aberrantes [6, 7]. Por ejemplo, los estudios en p190 RhoGAP ratones knockout puso de manifiesto que la RhoGAP es necesaria para axón derivación, orientación y fasciculación y morfogénesis neuronal [8, 9]. Genéticos aberraciones en dos RhoGAPs neuronal, es decir, oligophrenin y MeGAP/srGAP3, se había encontrado en dos tipos distintos de retraso mental humana [10, 11]. Rho GTPase defectuosa señalización también ha sido implicado en la tumorigénesis y metástasis [7, 12]. El RhoGAP miembro DLC1 (suprimido en el cáncer de hígado 1) se ha puesto de manifiesto que se eliminen en un gran número de primaria de carcinoma hepatocelular (CHC) y HCC celda con la implicación de su papel en la inhibición de la invasión y tumorigenicity [13, 14]. La kinasa de adhesión focal asociado RhoGAP, GRAF, se identificó como socio de una fusión de la sociedad mixta de leucemia de linaje (MLL) único gen de la translocación cromosómica en la leucemia mielomonocítica juvenil [15]. La fusión de BCR con oncogén ABL es una leucemia asociada a la translocación cromosómica que se tradujo en la fusión de proteínas P120 y p190 que carecían de la RhoGAP dominio del BCR [16].

El RhoGAP familiar se define por la presencia de aproximadamente 150 aminoácidos conservados RhoGAP dominio en los principales secuencias de proteínas y comparte al menos el 20% de homología de secuencia entre los miembros de la familia [3, 16]. La unión de la RhoGAP dominio con GTP-obligado proteínas Rho GTPase acelera la actividad de este último. Una subfamilia de los recientemente descubiertos RhoGAP las proteínas que consiste en ArhGAP9 y ArhGAP12 contienen una variada combinación de dominios funcionales de proteínas, incluyendo RhoGAP, SH3, WW PH y dominios [17, 18]. ArhGAP9 se informó de que se activa hacia cdc42 y Rac1, pero no RhoA y reprimir a la adhesión de una leucemia humana de células línea KG-1 a colágeno y fibronectina [17].

Uno de los principales tema importante en la señalización molecular está regulada proteína-proteína interacciones que dan como resultado el montaje de complejos de proteínas para transmitir señales intracelulares, para permitir el control de la especificidad de señalización y mediar entre hablar entre las diferentes vías de señalización a fin de coordinar los resultados. Estas interacciones moleculares regulados se producen a través de dominios de proteínas definidas y complementarias reconocimiento motivos por los socios vinculante.

El dominio WW es un 35-40 aminoácidos de proteínas interacción de dominio con dos residuos de triptófano firma espaciados por 22 aminoácidos [19, 20]. WW dominios reconocen varias clases de diferentes ligandos péptido que comprende la prolina-secuencias ricas, como PPDY, PPLP, PPPPP, PPXPPXR, PPRXXP (X: cualquier aminoácido), PR motivos o fosforilados serina o treonina-prolina (PT / PS)-P sitios. WW dominios se encuentran en muchos eucariotas y están presentes en aproximadamente el 50 proteínas humanas [19] y se han clasificado en cuatro grupos sobre la base de su carácter vinculante para los diferentes tipos de péptidos ligandos. Grupo I WW dominios se ha demostrado que reconocer PY motivos, los grupos II y III WW dominios tienen relativamente amplio y especificidad para la superposición de ligandos que comprende PPLP y PR motivos, y Grupo IV WW reconocer los dominios (PS / PT)-P motivos. Interrupción del dominio WW interacciones ha sido implicado en el cáncer [21 - 23] y en las enfermedades hereditarias como la distrofia muscular de Duchenne [20], el síndrome de Liddle de la hipertensión [24, 25], el síndrome de Rett [26], así como en La enfermedad de Alzheimer [27 - 29] y las enfermedades de Huntington [30, 31].

Presentamos aquí que ArhGAP9 humanos es una novela de acoplamiento de las proteínas MAP quinasas p38 y Erk2 α. Se demuestra que la unión de las agrupaciones que participan de manera complementaria los cargos de residuos ubicado en el común de acoplamiento (CD) de dominio de p38 y Erk y el C-terminal de la región WW ArhGAP9 de dominio, y que a través de esta interacción, entre el hablar entre Rho GTPase y MAP quinasa vías de señalización puede ocurrir para el control de actina remodelación.

Resultados
Novela interacción entre Erk y p38 MAP quinasas y la WW de dominio de la ArhGAP9 RhoGAP

ArhGAP9 y ArhGAP12 son muy similares RhoGAP proteínas que poseen el SH3, WW, PH y RhoGAP dominios. Hemos clonado la larga duración del ratón ArhGAP9 cDNA (genes no adhesión. DQ498128 ) Y encontró que a pesar de que comparte el 64% de identidad de secuencia con ArhGAP9 humanos, que carece del dominio WW (Fig. 1a]. De acuerdo con la SMART herramienta de predicción de dominio [32], bovinos, caninos y primates ArhGAP9 contener el SH3, WW, PH y RhoGAP dominios, murino y rata ArhGAP9 contener el SH3, PH y RhoGAP dominios y la falta de dominio WW. Es posible que la supresión genómica resulta en la pérdida del dominio en la Primera Guerra Mundial se ha producido ArhGAP9 roedores. Para entender la función de señalización de la WW de dominio en ArhGAP9 de los organismos que mantener este dominio, pruebas de interacción de proteínas para el dominio de WW ArhGAP9 humanos. La proteína de fusión GST de la WW de dominio humano ArhGAP9 inmovilizado en glutatión Sepharose bolas se utilizó como cebo para aislar las proteínas que interactúan el cerebro de rata lisado utilizando la proteómica (Fig. 1b]. Varias proteínas de unión específica se identificaron, entre ellas el MAP quinasa Erk2 de bandas f g y que generó 15 péptidos único que cubre el 40% de la secuencia de la proteína de Mitogen-proteína quinasa activada 1 (MAPK1, también Erk2). La otra correspondió a bandas de otras proteínas se caracterizaron por separado de este informe.

Encuadernación de Erk2 y p38 α a ArhGAP9 humanos in vitro e in vivo

Erk2 vinculante para el dominio de WW humanos ArhGAP9 fue confirmada por in vitro ensayos menú desplegable (Fig. 2a]. Bandera de etiquetado Erk2 se expresó en células 293T y los lisados preparados se incubaron con proteína de fusión GST de la WW dominio de ArhGAP9 inmovilizado en glutatión Sepharose bolas (ArhGAP9-WW-GST). La unión de dos estrechamente relacionados con el MAP quinasas, p38 y α Jnk1, también fue probado. De acuerdo con datos de la proteómica, Erk2 fue precipitada por ArhGAP9-WW-GST [Fig. 2 bis (i]]. Aunque p38 α también mostró vinculante aunque en menor medida que Erk2, la unión de Jnk1 no era detectable en el menú desplegable de ensayo. De larga duración ArhGAP9 fue también demostrado ser capaz de obligar a inmovilizados o Erk2 recombinante p38 α (Fig. 2b]. El uso de coimmunoprecipitation experimentos, la unión de p38 o Erk2 α a ArhGAP9 en vivo fue confirmada [Fig. 2c (i]]. Teniendo en cuenta que Erk2 α y p38 no mostró vinculante para los dos dominios de WW ArhGAP12 (ArhGAP12-WW1 y ArhGAP12-WW2) o el primer dominio de WW Nedd4 (Nedd4-WW1) [Fig. 2d (i]], la unión de Erk2 y p38 α a la WW de dominio se ArhGAP9 específicas.

Como ratón ArhGAP9 no contiene un dominio WW, hemos probado si la proteína sería capaz de interactuar con el MAP quinasas p38 y Erk2 α como el ser humano ortholog. Una fusión GST de un N-terminal del fragmento de la proteína del ratón ArhGAP9 (mArhGAP9-N), compuesto de aminoácidos 1-350 que incluyen el SH3 y PH de dominio y la intervención de secuencia entre estos dos dominios se consideró incapaz de obligar a Erk2 y p38 α, si se comparan con humanos ArhGAP9 WW dominio [Fig. 2e (ii]]. El uso de coimmunoprecipitation experimentos, se confirmó que el pleno de longitud ArhGAP9 ratón no puede interactuar con Erk2 in vivo (Fig. 2f]. Tomados en conjunto, se concluye que ArhGAP9 humanos interactúan con Erk2 α p38 y específicamente con su dominio WW y ortholog el ratón que carecía de un dominio WW fue incapaz de obligar a MAP quinasas.

MAP quinasa y ArhGAP9 vinculante fue mediada por la complementariedad cargado residuos en CD y dominios WW, respectivamente

Secuencia de alineación humanos ArhGAP9-WW dominio con todos los dominios conocidos WW puso de manifiesto que el C-terminal final de ArhGAP9 humanos-WW dominio que figura una única base di-Arginina motivo (R246 y R247) que no están presentes en todos los demás dominios en comparación WW (datos no presentados). La alineación de los dominios de WW ArhGAP12 humanos y ArhGAP9 puso de manifiesto que en el primer y segundo WW dominios de ArhGAP12 que no obligará a Erk2 α y p38, los aminoácidos en la alineación con R247 son hidrofóbicas residuos W e Y, respectivamente (Fig. 3 bis] . Por lo motivos básicos, denominado de acople (D) dominios, se había encontrado a estar presentes en muchos MAP quinasa de acoplamiento que unen a las proteínas para la conserva de acoplamiento (CD) dominios de MAP quinasas [33 - 36]. El CD de dominios Erk2, p38 y JNK consisten en conserva residuos ácidos que forman las interacciones electrostáticas con los residuos de base de la meta de acoplamiento de proteínas [33 - 36]. Por lo tanto, hemos examinado la posibilidad de que la interacción entre los residuos de manera complementaria con cargo a los dominios de CD o Erk2 α p38 y WW ArhGAP9 de dominio podría ser el mecanismo que mayor o mediada por la unión de estas MAP quinasas y ArhGAP9. Hemos investigado si la base de residuos en el dominio de WW humanos ArhGAP9 que mediar la unión a p38 y Erk2 α a través de la interacción con los residuos de ácidos en el CD de dominio, como es el caso de otros MAP quinasa de acoplamiento de proteínas. R246 y R247 en el dominio de WW humanos ArhGAP9 fueron mutados a Alanina (ArhGAP9-WW-RR) y la unión de Erk2, p38 α o Jnk1 se puso a prueba. Como se muestra en la Fig. 3b (i], para ambos Erk2 α y p38, la unión a la WW de dominio con el R246, 247 bis mutación se redujo significativamente en comparación con carácter vinculante a su forma natural ArhGAP9 WW dominio, lo que confirma que estos residuos básicos que desempeñan un papel en el MAP quinasa interacción. Única de mutación R246A o R247A es también deficiente en unión a Erk2 (Fig. 3c]. La unión de larga duración R246, 247 bis (RR) de mutantes ArhGAP9 a Erk2 o α p38 se redujo significativamente en relación a su forma natural ArhGAP9 in vivo utilizando coimmunoprecipitation experimentos (Fig. 3d]. Por lo tanto, R246 y R247 en el dominio de WW ArhGAP9 son importantes en la mediación obligatoria para los Erk y p38 MAP quinasas. Además vinculante análisis indica que los residuos en las proximidades de esta di-Arginina motivo, a saber, K243, P244 y P245 con la WW de dominio también contribuyó a vinculantes de ArhGAP9 con MAP quinasas (Fig. 3e].

Para examinar si el CD dominios en el MAP quinasas p38 y Erk2 α fueron las regiones que se comunicaron con el dominio de WW ArhGAP9, GST fusiones de un C-terminal de Erk2 fragmento que contiene el CD de dominio (Erk2-CD-GST, los residuos 300-358 ) Y una versión de suprimirse Erk2 que carecen de la Conferencia de Desarme de dominio (Δ Erk2-CD-GST, los residuos 1-300) fueron construidos. La unión de tipo salvaje o R246, 247 bis mutante de ArhGAP9 inmovilizados con Erk2-CD-GST y Erk2 Δ-CD-GST fueron probados [Fig. 4 bis (i]]. Wild ArhGAP9 tipo pero no la R246, 247 bis mutante, específicamente precipitado con Erk2-CD-GST, lo que indica que el CD de dominio fue suficiente para mediar Erk2 vinculante para ArhGAP9. En consonancia con esta noción, Erk2 Δ-CD-GST no obligar tipo salvaje ArhGAP9 [Fig. 4 bis (ii]].

A fin de determinar si los residuos de ácidos conservadas [Fig. 4b (i]] en el CD dominios del MAP quinasas son importantes en la mediación vinculante para el dominio de WW ArhGAP9, punto mutantes de p38 y Erk2 α como se indica en la Fig. 4b (ii ] Se han generado y puesto a prueba para su unión a ArhGAP9. Como se muestra en la Fig. 4b (ii], las mutaciones D316A en Erk2 y D312A, D315A, y E316A en p38 α causado una reducción significativa en la interacción con ArhGAP9-WW dominio. Estos resultados indican claramente que los residuos de ácidos en los dominios de CD y Erk2 α p38 son importantes para sus interacciones con ArhGAP9. Otras mutaciones puntuales de p38 y Erk2 α incluidas las sustituciones de aminoácidos en el bucle de activación de la quinasa de dominio no afecta a la unión (Fig. 4c]. Más datos que confirman que el dominio de WW ArhGAP9 interactuaron directamente con el CD de dominios Erk2 y p38, pero no se obtuvo Jnk1 Lejos de UV-espectroscopía de dicroísmo circular (Fig. 4d]. El dominio WW es un pequeño de tres hundidos β-hoja estabilizado por el apilamiento de varios conservadas aromáticos y residuos de prolina [37 - 40]. Cristal y estructuras de solución de dominios WW ha demostrado que los dominios WW someterse a cambios conformacionales vinculante para su péptido ligandos [19, 20, 41]. Se aplicaron Far-UV espectroscopía de dicroísmo circular para investigar los cambios conformacionales a la unión de Erk2, p38 α o Jnk1 péptidos correspondientes a los dominios de acoplamiento comunes con el dominio de WW ArhGAP9. Los péptidos que contiene 14 aminoácidos en común de acoplamiento de dominios Erk2, p38 y α Jnk1 fueron sintetizados [secuencias se muestra en los procedimientos experimentales y en la Fig. 4b (i]]. Para analizar los cambios en la estructura de dominio a WW unión de péptidos correspondientes, las diferencias en el Far-UV dicroísmo circular espectro de ArhGAP9 WW dominio soluciones a la presencia o ausencia de los péptidos fueron controlados. Los cambios en la estructura secundaria contenidos fueron analizados mediante el programa CDNN, versión 2,1 [42]. El análisis mostró que la recombinante ArhGAP9 WW dominio plegada correctamente y que poseen la mayoría de β-hojas y bobinas al azar que son similares a las conocidas WW dominios [Fig. 4D (i]]. En presencia del péptido en Erk2 concentración equimolar, ArhGAP9 WW dominio mostraron diferencias significativas en los espectros de dicroísmo circular en particular de 190-205 nm [Fig. 4D (iv]]. En presencia del péptido p38 α, ArhGAP9 WW dominio también mostró una diferencia significativa en los espectros de dicroísmo circular en la misma región [Fig. 4D (iii]]. En contraste, la adición de Jnk1 péptido no alteró los espectros de dicroísmo circular significativa, aunque hubo notables cambios a 220-235 nm [Fig. 4D (ii]]. Estos cambios conformacionales supervisado por el Lejano-UV dicroísmo circular estaban de acuerdo con los demás conocida solución de cristal y estructuras de proteínas WW péptido con sus objetivos. Este resultado apoya la conclusión de la in vitro e in vivo los experimentos que ambos Erk2 y p38 α interactuó con ArhGAP9-WW Jnk1 dominio pero no lo hicieron. Sin embargo, los cambios conformacionales exacto y el mecanismo de obligatorio sólo puede obtenerse por resolver la solución de cristal o las estructuras de ArhGAP9-WW dominio en complejo con sus socios vinculante. Los datos descritos anteriormente indicado con firmeza que la unión entre ArhGAP9 y el MAP quinasas Erk y p38 es específico y está mediada por la Primera Guerra Mundial y CD dominios de ArhGAP9 y el MAP quinasas, respectivamente.

Para obtener información sobre la base estructural de la especificidad de dominio WW de ArhGAP9 vinculante para Erk2, p38 y Jnk1 α, se compararon los tres estructuras dimensionales de CD dominios de las tres proteínas. Se podría verse en la comparación que, si bien la estructura general de Erk2 (AP id: 1ERK), p38 α (AP id: 1P38) y Jnk1 (AP id: 1JNK) son muy similares, la Conferencia de Desarme de dominio compartido p38 α mayor que la homología de Jnk1 a Erk2. Por otra parte, mientras que Erk2 y p38 α son significativamente super-imponer con RMSD de 0,68 Å [Fig. 4e (i]], Erk2 y Jnk1 CD dominios son bastante distintos con RMSD de 2,18 Å [Fig. 4e (ii]]. El alto secuencia y la semejanza estructural entre Erk2 α p38 y proporcionó algunas ideas sobre la base estructural de la especificidad en el dominio de WW ArhGAP9 para Erk2 y p38 α pero no Jnk1, como se observa en la unión estudios in vitro e in vivo.

Coexpression de MAP quinasa quinasas (MAPKKs) una reducción vinculante de MAP quinasas (MAPKs) a WW dominio de ArhGAP9

El CD de dominios MAP quinasas se ha establecido como la unión de sus aguas arriba para la activación de cinasas, es decir, MEK1 y 2 de Erk1 y 2, y MKK3, 4 y 6 de p38 α. [33, 35, 36, 43]. Algunos otros reguladores, los efectores, así como sustratos MAP quinasa también se han establecido a atracar en el CD dominios. Estas proteínas de acoplamiento contienen residuos de carga positiva que forma el acoplamiento (D) de dominio con carácter vinculante para la Conferencia de Desarme de dominio MAP quinasas [23, 25 - 27]. A partir de nuestros datos que la unión de ArhGAP9 a Erk2 y p38 α requiere un di-Arginina motivo a la WW de dominio y conserva los residuos ácidos en el CD de dominio, es posible que la unión de D de dominio que contengan proteínas como MEK2 y MKK6 pueden competir con la unión de ArhGAP9 a Erk2 α y p38, respectivamente. Por lo tanto, comparó la unión de p38 a ArhGAP9 α-WW dominio en la ausencia o presencia de overexpressed MKK6 [Fig. 5 bis (i]]. La cantidad de p38 α que precipitó la Primera Guerra Mundial con el dominio ArhGAP9 se redujo significativamente en presencia de MKK6, lo que indica que es posible que la unión de MKK6 a α p38 podría inhibir la unión de la WW ArhGAP9 dominio. En consonancia con lo anterior los datos in vitro, la unión de larga duración ArhGAP9 a p38 α in vivo se redujo a la presencia de MKK6 (Fig. 5b]. Tuvimos también observó que un mutante de la MKK6 con base en residuos de la categoría D de dominio responsables de la unión a la Conferencia de Desarme de dominio de α p38 suprime el no de obligar a p38 α y, por tanto, para inhibir p38 α vinculante para el dominio WW ArhGAP9 (datos no presentados). Del mismo modo, con la cotransfection de MEK2, la cantidad de ArhGAP9 que co-immunoprecipitated con Erk2 se redujo significativamente (Fig. 5c]. En conjunto, estos resultados indican que la activación de cinasas aguas arriba de p38 y Erk2 α, es decir, MKK6 y MEK2, respectivamente, fueron capaces de perturbar la unión de las MAP quinasas a la WW de dominio de ArhGAP9, muy probablemente debido a su acoplamiento en el CD dominios y competitiva prevenir la unión de ArhGAP9.

Encuadernación de ArhGAP9 inhibido Erk2 α p38 y la activación de las señales de aguas arriba

Dado que ambos ArhGAP9 y el MAP quinasas poseen actividades catalizadoras, que abordó la cuestión de si su interacción puedan influir en sus actividades. Furukawa et al [7, 17], así como nuestros datos no publicados muestran que ArhGAP9 funcionado como un activo GTPase la activación de proteína (BPA), hacia cdc42 y Rac1, pero no RhoA. Para determinar si MAP quinasa vinculante tenido ningún efecto sobre la actividad RhoGAP de ArhGAP9, se compararon los niveles de cdc42 activa en la lisados de las células transfectadas con ArhGAP9 en la presencia o ausencia de p38 o Erk2 α utilizando la Pak vinculantes de dominio (PBD) GST método (Fig. 5d]. A través de la alineación de secuencias de proteínas de la RhoGAP dominio de ArhGAP9 humanos y otros conocidos RhoGAPs cuyas actividades y estructuras se han determinado, hemos identificado R578 en humanos ArhGAP9 como el 'dedo de la mano Arginina' residuo esencial para la actividad GAP. Hemos mutado R578 es la lisina y confirmó que ArhGAP9 (R578K) fue catalíticamente inactiva in vitro de los ensayos de BPA (datos no presentados). El uso de la GAP-mutante inactivo de ArhGAP9 (R578K) como un control negativo para el ensayo, hubo claramente un efecto no significativo en la actividad con o sin la presencia de p38 o Erk2 α.

Estamos próximos investigó si la unión de ArhGAP9 a la p38 y Erk2 α tenido un efecto sobre la MAP quinasa. 293T células fueron transfectadas con p38 α-Flag solo, o α-p38 Bandera con EGFR para inducir la activación de p38 α, α p38 o con EGFR, así como ArhGAP9, ya sea de tipo salvaje o el W242K, R246, 247 bis (WRR) triple mutante que era defectuoso en unión a p38 y Erk, como se indica en la Fig. 5e. Como se indica por el Western Blot con α-fosfato-p38 en la Fig. 5e (v], p38 α transfectadas solo mostró un ligero nivel detectable de activación basal que aumentó significativamente con la coexpression de EGFR. Con la expresión de tipo salvaje ArhGAP9, una reducción de α p38 inducida por la activación de EGFR se observó, lo que indica que ArhGAP9 podría suprimir la activación de p38 α abajo del EGFR. Con coexpression de la ArhGAP9 (WRR) mutante, hubo una menor supresión de p38 α activación de EGFR lo que indica que este mutante es capaz de restaurar parcialmente p38 α activación de EGFR inhibe de tipo salvaje ArhGAP9. Este resultado sugiere fuertemente que la unión de ArhGAP9 a MAP quinasas impidió la activación de este último aguas arriba de su quinasas.

Además, confirmó que este efecto inhibidor no se atribuyera a la RhoGAP actividad, pero a la WW de dominio de ArhGAP9. 293T células fueron transfectadas con p38 α-Flag solo, o α-p38 Bandera con EGFR, p38 o α con EGFR, así como ArhGAP9, ya sea de tipo salvaje, el GAP-mutante inactivo (R578K) o el dominio WW mutantes (W219K o W242K), como se indica en la Fig. 5f. Como se muestra en la Fig. 5f (iv], el efecto supresor de tipo salvaje en ArhGAP9 EGFR inducida por la activación de p38 no se vio afectada por la mutación R578K, pero fue parcialmente revocada por la W219K o W242K mutación.

Tomados en conjunto, estos datos demuestran que (a) la unión de ArhGAP9 MAP quinasas a través de su dominio WW provocado la inhibición de la activación de MAP quinasa aguas arriba de las señales y (b) esta interacción no tiene un efecto significativo sobre la actividad RhoGAP de ArhGAP9 . (c) Además, el efecto inhibidor de ArhGAP9 MAP quinasa en la activación es independiente de su actividad RhoGAP.

ArhGAP9 vinculante impedido MAP quinasa inducida por la pérdida de las fibras de actina estrés en fibroblastos

Rho GTPase MAP quinasa y de señalización han sido implicados en el control del citoesqueleto de actina. Concretamente se informó de que la activación de las MAP quinasas Erk1, 2 y 5 vías causado perturbación del citoesqueleto de actina [44]. Para investigar si la interacción de ArhGAP9 y MAP quinasas tenido un efecto en el citoesqueleto de actina, ArhGAP9 (tipo salvaje o R246, 247 bis mutante) y las buenas prácticas agrarias-actina heterologously se expresa en las células 3T3 suizos por microinyección de los respectivos cDNAs, seguido por imágenes en vivo de la estructura de actina. Como se muestra en la Fig. 6a, en presencia de tipo salvaje ArhGAP9, las células que poseen distintos haces de fibras de actina estrés como en el control de las células donde GFP-actina Se expresó por sí solo. Sin embargo, en presencia de la R246, 247 bis ArhGAP9 mutante, el estrés y las fibras disuelto mostró un patrón difuso citosólica de la distribución de actina. Estos resultados apoyaron la hipótesis de que la unión de tipo salvaje ArhGAP9 a MAP quinasas secuestrado en la forma inactiva, la prevención de la activación de las MAP quinasas y, por tanto, permitir la formación y el mantenimiento de las fibras de actina estrés en los fibroblastos. Por el contrario, la R246, 247 bis mutante no poder obligar a la MAP quinasas, podría permitir la activación de las MAP quinasas a resultar en el desmontaje de las fibras de actina estrés.

Discusión

ArhGAP9 es un poco identificado RhoGAP que contiene cuatro dominios funcionales incluidas SH3, WW, PH y RhoGAP. Curiosamente, los roedores orthologs no contienen la WW de dominio a pesar de compartir más de un 60% de identidad con los caninos, bovinos y primates proteínas. Nos centramos en el estudio de la función (s) de la WW de dominio en ArhGAP9 humanos y demostró que posee una única especificidad ligando. El uso de la proteómica y espectrometría de masas nos dimos cuenta de que la WW de dominio del ser humano ArhGAP9 asociados específicamente con la MAP quinasa, Erk2. El dominio de WW ArhGAP9 también vinculado a otro miembro de la familia MAP quinasa, p38 α, aunque con una menor afinidad al parecer, pero no a Jnk1. El Erk2 α p38 y las proteínas no contienen ninguna PPDY, PPLP, PPPPP, PPXPPXR, PPRXXP, motivos o PR (PT / PS)-P determinado para WW dominio vinculante, lo que indica que el dominio de WW ArhGAP9 había un nuevo ligando especificidad de los distintos Actualmente, cuatro grupos establecidos. Además, puso de manifiesto que la unión de la WW dominio de ArhGAP9 con Erk2 o α p38 fue mediado a través de la complementariedad entre los residuos cargado la C-terminal final de la WW dominio de ArhGAP9 y conserva el común de acople (CD) de dominio o en Erk2 α p38 y propuso que ArhGAP9 es una novela Erk2 α p38 y la proteína de acoplamiento. La unión entre el dominio de WW ArhGAP9 humanos y el MAP quinasas es más probable es que no sólo mediado por las interacciones electrostáticas entre las di-Arginina motivo por el dominio de WW ArhGAP9 y los residuos de ácidos en el CD de dominio de las MAP quinasas. Estas interacciones pueden, no obstante, ser importante en el suministro de las fuerzas electrostáticas de dirección para controlar el tipo de asociación o de especificidad vinculante. La estructura tridimensional de Erk2 muestra que la Conferencia de Desarme de dominio se encuentra en la superficie opuesta de Erk2 de la activación de bucle, el apoyo a nuestros datos que la activación de bucle región no ha participado en unión a la WW de dominio de ArhGAP9. En este estudio, hemos identificado que un di-Arginina motivo (R246 y R247) en el C-terminal de la región WW dominio de ArhGAP9 era importante para la unión a MAP quinasas como la mutación de estos residuos básicos, ya sea individualmente o junto abolido la unión de larga duración o la ArhGAP9 WW dominio solo a Erk2 o p38 α. También hemos mapeado los residuos de ácidos en el CD de dominios Erk2 y 38 α necesarios para unirse a la WW de dominio de ArhGAP9. Los residuos D316 en Erk2 y D312, D315, E316 y en α p38 han resultado ser importantes para la unión a ArhGAP9. Aunque es evidente que el di-Arginina motivo por el C-terminal de la región WW dominio, así como los dos residuos de triptófano firma son importantes para la unión a p38 y Erk2 α, el mecanismo estructural global de MAP quinasas vinculante para el dominio de WW ArhGAP9 y los demás residuos en la WW de dominio y el MAP quinasas que también podría contribuir a la unión especificidad y afinidad queda por determinar. La determinación de la estructura tridimensional de la ArhGAP9 WW dominio en un complejo con p38 o Erk2 α proporcionará más datos sobre la contribución de otras regiones del dominio WW y MAP quinasas en la interacción.

La unión de ArhGAP9 humanos y el MAP quinasas p38 y Erk2 α representa otro ejemplo de la recientemente descubierta transversal hablar mecanismo entre la Rho GTPase y MAP quinasa vías de señalización. Hay 2 últimos informes de ejemplos de interacción con RhoGAPs Erk, es decir, IQGAP1 y CdGAP. En el caso de IQGAP1, Erk2 se une al dominio de WW IQGAP1 aunque los residuos que participan no se ha dilucidado. La sobreexpresión o la reducción de IQGAP1 expresión de siRNA tanto causó la activación de Erk2 de FEAG o IGF-1 en MCF-7 células que vayan a reducirse, debido probablemente a un nivel óptimo de IQGAP1 intracelulares que son necesarias para el máximo nivel de activación de Erk de FEAG o IGF-1 [45]. El dominio de WW IQGAP1 no contiene residuos de base análoga a la R246 y R247 en ArhGAP9 y que había encontrado que Erk2 vinculado con una afinidad mucho más bajos que ArhGAP9 (datos no presentados). En el caso de CdGAP, Erk1 se une a la RhoGAP a través de una supuesta DEF (D ocking para E F rk XFP), lo que resulta en la fosforilación de la RhoGAP de la MAP quinasa y la inhibición de su actividad RhoGAP [46]. CdGAP no contiene una WW de dominio y, por tanto, espera asociarse con Erk diferentes a través de un mecanismo de acoplamiento.

La actividad RhoGAP de ArhGAP9 no fue significativamente alterada como consecuencia de la interacción con MAP quinasas sino por el contrario, la activación de las MAP quinasas fue suprimida por la interacción. La unión de Erk2 o p38 en la célula α a ArhGAP9 se redujo significativamente en presencia de MAP quinasa de acoplamiento de proteínas, como la activación de cinasas aguas arriba, es decir, MEK2 para Erk2 o MKK6 para p38 α. La hipótesis de que en el estado quiescent, ArhGAP9 podrán quedar vinculadas a Erk2 o α p38 en la célula a través de su dominio WW de acoplamiento en el CD de dominio de las MAP quinasas. Cuando las señales ascendentes se suscitó a activar el MAP quinasas, la unión de ArhGAP9 se redujo, probablemente debido al desplazamiento competitivo de otras proteínas de acoplamiento, es decir, la MAP quinasa quinasas, MEK para Erk y MKK3, 4 o 6 para p38. La localización subcelular y las concentraciones de proteínas de acoplamiento es más probable principales factores determinantes de las interacciones de acoplamiento con MAP quinasas. Hemos propuesto un modelo para la regulación negativa de MAP quinasa señalización de ArhGAP9 como se ilustra en la Fig. 6b. De acuerdo con esta hipótesis, nuestros datos muestran que, si bien de tipo salvaje ArhGAP9 significativamente Erk2 o α p38 inducida por la actividad de EGFR, los mutantes de ArhGAP9 que era defectuosa en vinculante para el MAP quinasas resultado sólo marginal en la represión del EGFR inducida por la activación MAP quinasa.

Tanto el Erk y p38 MAP quinasas desempeñar funciones de señalización fundamental en el desarrollo y los procesos celulares, incluyendo citoesqueleto cambios que subyacen en el aumento de la motilidad celular y la disminución de la adhesión celular en la transformación y la metástasis. En casi todos los tipos de cáncer, el Erk MAP quinasa es constitutivamente activa, que confiere una mayor proliferación y resistencia a la apoptosis estímulos, incluidos los químicos fármacos citotóxicos. El Erk MAP quinasa es, por tanto, un objetivo de gran relevancia para la intervención terapéutica en cáncer. Amplia bibliografía ha demostrado que el barrio de Ras / Raf / Erk camino abajo de ras o src oncogenes es necesaria para la interrupción de las fibras de actina estrés y adherencias focales transformado en diferentes líneas celulares, lo que indica la importancia de Erk 1 y 2 actividad en la remodelación del citoesqueleto de actina [ 44, 47 - 49]. La activación de Erk en células transformadas se ha demostrado que causa la baja regulación de Rho-cinasa expresión [49] y la activación de LIM cinasa [50, 51]. Rho-cinasa phosphorylates miosina cadenas ligeras y regula negativamente la miosina fosfatasa, que resultan en un aumento de acto-miosina basada en la contractilidad [52, 53], que contribuyen a la formación de fibras de estrés y contactos focales. LIM cinasa phosphorylates cofilin dar lugar a la inhibición de su actina-depolymerization actividad contribuyendo así a la estabilización de fibra de actina [50, 51]. En consonancia con estas funciones informó de Erk actividad en el control de la actina cytokeleton, nuestros resultados mostraron que la expresión de tipo salvaje ArhGAP9 preservado el estrés en las fibras de fibroblastos. Por el contrario, expresión de la R246, 247 bis mutantes defectuosos en unión a Erk causado dramáticos desmontaje de las fibras de actina estrés, con la actina unpolymerized distribuido a los citosol.

Nuestros datos demuestran que colectivamente ArhGAP9 es una novela de acoplamiento de las proteínas MAP quinasas Erk y p38, JNK, pero no. A través de una serie de bioquímicos, biofísicos y celulares basados en experimentos, hemos aportado pruebas de que la activación de las MAP quinasas aguas arriba de la activación de cinasas fue suprimida por ArhGAP9 vinculante tanto in vitro como in vivo. Esto proporciona una base para una previamente inexplorada mecanismo molecular de modular la actividad MAP quinasa y podría estudiarse más a fondo para el desarrollo de nuevos inhibidores de la señalización MAP quinasa por la ruptura de MAP quinasa unión a proteínas de acoplamiento en el CD de dominio. Esta estrategia debería permitir una mayor selectividad en la orientación MAP quinasas en comparación con la más general ATP vinculante interferencia. De hecho, utilizando el ordenador con ayuda de drogas de diseño (CADD), nuevos compuestos que alteran las interacciones entre Erk y su acoplamiento a través de las proteínas y el CD D dominios han sido identificados y han mostrado ser eficaces en el bloqueo de Erk activación en las células [34, 54 -- 56].

Materiales y métodos
Los anticuerpos

α-Flag (M2) y α-fosfato-p38 fueron de Sigma, α-fosfato Erk fue de Señalización Celular Tecnología, α-HA (12CA5) fue de Boerhinger, α-ArhGAP9 generado por procedimiento estándar de vacunación con el de larga duración ArhGAP9 humanos-GST como el inmunógeno. α-fosfotirosina conjugado con peroxidasa caballo rábano (HRP-PY20) fue de Transducción Laboratories, α-EGFR fue de Santa Cruz de Biotecnología.

Líneas celulares

293T células fueron cultivadas en Dulbecco del mínimo indispensable medio (DMEM) que contiene 4,5 g / l de D-glucosa, 10% (v / v) de suero fetal bovino (HyClone), 10 mM L-glutamina, y 100 μ g cada una de la penicilina y la estreptomicina / ML de Sigma. Swiss 3T3 se cultivaron en DMEM que contiene 4,5 g / l de D-glucosa, 10% (v / v) de suero de ternera Cósmica (HyClone), 10 mM L-glutamina, y 100 μ g cada una de la penicilina y la estreptomicina / ml.

Plásmidos

ArhGAP9 Humanos (tipo salvaje y los mutantes) y la codificación de EGFR cDNAs fueron clonados en el vector de expresión de mamíferos pRK5. Erk2, p38, Jnk1 cDNAs fueron clonados en pxJ40-Bandera con un vector N-terminal Bandera etiqueta. HA-etiquetados activado MEK2 (S222D, S226D) fue clonado en pUSEamp vector. Activado MKK6 (S207E, T211E) fue clonado en pxJ40-HA vector. Plásmido codificación Pak vinculante de dominio (PBD)-GST se obtuvo del doctor E Manser (CMM, A-STAR, Singapur). Cdc42-myc fue clonada en pcDNA3. Por la expresión transitoria en células de mamífero, Lipofectamine (Gibco BRL) se utiliza para la transfección, tras el protocolo recomendado por el fabricante. Mutaciones puntuales se introdujeron con la Quikchange sitio mutagénesis dirigida kit (Stratagene) y las mutaciones fueron confirmadas por secuenciación del ADN.

Proteínas de expresión y purificación

Por expresión de glutation S-transferasa (GST), proteínas de fusión, las secuencias de cDNA fueron clonados en el vector pGEX4T1 (Pharmacia). Las proteínas de fusión GST se expresaron en E. coli BL21 (DE3) las células y purificado utilizando glutatión sepharose 4B cromatografía en columna (Amersham). Para Extremo-CD espectroscopía UV, la etiqueta se GST exfoliados con la trombina proteasa de la noche a la mañana en la columna de la digestión a 4 ° C. La proteína resultante preparación fue nuevamente purificada por medio de intercambio iónico Mono columna Q Sepharose (Amersham), que había sido pre-equilibrio con un buffer (20 mM Tris-HCl pH 7.5). La proteína se eluye de la columna con un gradiente lineal de buffer B (20 mM Tris-HCl pH 7,5, 1 M NaCl). La proteína fue purificada utilizando Superdex-75 gel filtración en cromatografía en columna biológico Duoflow sistema FPLC.

Proteómica y análisis de espectrometría de masas

Complejos de proteínas de la WW dominio de ArhGAP9 humanos aislados de cerebro de rata lisado se eluye y se resolvieron en un 10% SDS-PAGE, seguida por la detección de proteínas obligado por tinción con Azul Coomassie coloidal (Pierce). Específicas bandas fueron extirpados y sometidos a en-gel reducción, S-alquilación y tripsina hidrólisis. Cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS) análisis de los péptidos se realizó en un Finnigan LCQ Deca trampa de iones espectrómetro de masa (Thermo Finnigan) equipado con una fuente Nanospray (MDS Proteómica). Separación cromatográfica se realizó utilizando un Famos autosampler y un sistema de gradiente Ultimate (LC Embalajes) a lo largo de Zorbax SB-C18 resina de fase inversa (Agilent) envasados en 75 μ m PicoFrit columnas (Nueva Objetivo). Proteína identificaciones se realizaron utilizando los motores de búsqueda Mascota (Matriz de Ciencias) y Sonar (ProteoMetrics).

In vitro vinculante ensayos

Lisados por la unión y ensayos de inmuno-precipitación fueron preparados por la lisis de las células en el buffer de lisis celular [20 mM HEPES (pH 7,5), 137 mM NaCl, 1% Tritón X-100, el 10% de glicerol, 1,5 mM de MgCl 2, 1 mM EGTA, 0,1 mM Na 3 VO 4 y completa Inhibidores de la proteasa (Boehringer)], seguida por centrifugación 13000 g durante 15 minutos a 4 ° C y se percibe el sobrenadante. En el menú desplegable ensayos in vitro, las proteínas de fusión GST inmovilizado en glutatión bolas fueron incubadas con los lisados durante 1 hora a 4 ° C con la rotación, seguido por el lavado de las bolas con las proteínas específicamente vinculados con buffer de lisis celular de 5 veces, cada vez durante 5 con rotación min a 4 ° C. La proteína complejos fueron eluidos con tampón de Laemmli y resueltas por el sulfato de sodio dodecyl-electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE), seguida de borrones en las membranas PVDF y con la detección de anticuerpos específicos. Por inmuno-precipitación, los anticuerpos se han añadido a la lisados y se incubaron durante 1 hora a 4 ° C con la rotación, seguido por adición de Proteínas G A PLUS bolas (Calbiochem) para capturar la inmuno-complejos. Los inmuno-complejos fueron lavados y luego eluye con tampón de Laemmli y resueltas por SDS-PAGE, seguida por Western Blot con anticuerpos específicos.

Péptidos y el Lejano UV dicroísmo circular (CD) espectroscopía

Péptidos de Erk2: LEQYYDPSDEPIAE, p38 α: FAQYHDPDEPVAD y Jnk1: INVWYDPSEAEAPP fueron sintetizados por costumbre NeoSystems (Estrasburgo, Francia). CD experimentos se realizaron con un Jasco J-715 spectropolarimeter equipado con una célula Peltier titular y un PTC-348WI de temperatura. Far-UV CD espectros se midieron en una de 1 mm de cuarzo rectangular celda. El buffer utilizado fue de 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 500 mM de NaCl y 1 mM DTT. Concentración de proteínas de aproximadamente 0,5 mg / ml determinado por el método de Bradford ensayo se utilizó para las exploraciones de longitud de onda. Longitud de onda exploraciones se realizaron a una velocidad de exploración de 10 nm / min y el valor medio de 3 scans de la misma solución se obtuvieron. Los datos fueron recolectados a 25 ° C durante un rango de longitud de onda 190-260 nm con un ancho de banda de 1 nm. Para determinar los cambios conformacionales en el dominio a WW péptido vinculante, el ellipticity de los péptidos correspondientes a equimolar de concentración con el disolvente se restará de la ellipticity del dominio WW-péptido complejo y del mismo modo que el disolvente se sustrae del espectro de la gama de dominio antes de la Primera Guerra Mundial análisis. La medida espectros UV CD fueron analizados utilizando el análisis de la estructura secundaria CDNN programa, la versión 2,1 [42].

Microinyección de células vivas y de imágenes

Swiss 3T3 fibroblastos fueron chapados a 5 × 10 4 por plato con fondo de cristal y aumentado la noche a la mañana a 37 ° C en DMEM con 10% de suero de ternera Cósmica. ADN se inyectó a 0,5 μ g / ml en los núcleos usando una configuración personalizada y microinjector microscopio Olympus (Olympus IMT-2) y las células fueron devueltas a la incubación a 37 ° C durante la noche para permitir la expresión de proteínas. Por DIC fluorescencia y time-lapse análisis, las células fueron incubadas en un acalorado etapa a 37 ° C y con una imagen en un monocromador Zeiss Axiovert 200 M microscopio encerrada en una incubadora con CoolSNAP cámara CCD.

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

Agradecimientos

Este trabajo es financiado por la Agencia de Ciencia, Tecnología e Investigación (A-STAR), Singapur. La identificación de Erk2 como un objetivo vinculante para ArhGAP9 se inició el trabajo en el laboratorio del doctor Tony Pawson (Mt Sinai Hospital, Toronto, Canadá). El apoyo del profesor Sir David Lane (IMCB, Singapur) y la asistencia del doctor David Coomber (IMCB, Singapur) son reconocidas. La obra de arte para la figura 6b se hizo por el doctor Guy Grame.