Journal of Immune Based Therapies and Vaccines, 2007; 5: 4-4 (más artículos en esta revista)

Evaluación de un recombinante humano gelatina como sustituto de una hidrolizado de gelatina porcina en un refrigerador estable-Oka / Merck vivir la vacuna contra la varicela

BioMed Central
Vladimir Liska (vladimir_liska@merck.com) [1], Stacey A Bigert (stacey_bigert@merck.com) [2], Philip Bennett S (philip_bennett@merck.com) [3], David Olsen (DOlsen@Fibrogen.com) [4], Robert Chang (RChang@Fibrogen.com) [4], Carl J Burke (carl_burke@merck.com) [2]
[1] Vacunas Investigación Clínica, Merck Research Laboratories, PO Box 1000, UG3CD28, North Wales, PA 19454, EE.UU.
[2] y Vacunas Biológicas, Merck Research Laboratories, West Point, PA 19486, EE.UU.
[3] NonClinical Estadística, Merck Research Laboratories, West Point, PA 19486, EE.UU.
[4] FibroGen, Inc, South San Francisco, CA 94080, EE.UU.

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Resumen
Fondo

La naturaleza lábil de vivos, atenuados varicela-zoster virus (Oka / Merck) requiere de estabilización durante sólido a granel del virus de preparación y de fabricación de vacunas a fin de preservar a través de la potencia de almacenamiento y administración. Una estabilización de ingrediente utilizado en un virus varicela-zoster (VVZ) la vacuna es hidrolizado de gelatina porcina, lo que representa el principal proteína / péptido basado en excipiente en la formulación de vacunas.

Métodos

En este estudio comparativo, un recombinante humano gelatina fragmento (8,5 kD) se evaluó como posible sustituto de hidrolizado de gelatina porcina en forma experimental vivos, atenuados VZV (Oka / Merck) vacuna. VVZ (Oka / Merck) fue cosechado en dos formulaciones preparadas con un hidrolizado de gelatina porcina o una gelatina humana recombinante. Por otra parte, la estabilidad viral en la experimental VZV (Oka / Merck) las vacunas se evaluó en virtud de la aceleración y en tiempo real de condiciones en un estudio comparativo.

Resultados y discusión

El efecto estabilizador de gelatina humana recombinante en VZV (Oka / Merck) durante el cambio de potencia liofilización vacuna fue similar a la vacuna experimental que contiene derivados de la especie porcina gelatina. Vacunas virales potencia cambios son comparables a estabilizarse VZV (Oka / Merck) formulaciones que contengan cualquiera de hidrolizado de gelatina porcina o humana recombinante gelatina. No hay diferencia estadísticamente significativa en la estabilidad de potencia se observó entre las formulaciones de vacunas almacenadas en cualquiera de las temperaturas de prueba.

Conclusión

La gelatina humana recombinante demostró capacidad similar a estabilizar la vivos atenuados VZV (Oka / Merck) a título experimental, frigorífico-la vacuna contra la varicela estable en comparación con la vacuna formulada con preparación hidrolizado de gelatina porcina utilizada en la actualidad comercializa la vacuna contra la varicela.

Fondo

Vacuna contra el virus de la varicela en vivo es un preparado liofilizado de vivos, atenuados VZV (Oka / Merck) [1]. La labilidad inherente de los virus vivos de varicela (Oka / Merck) presenta una formulación desafío en términos de estabilización y conservación de la vacuna contra la viabilidad durante el proceso de fabricación, el almacenamiento y la administración [2]. El refrigerador de la vacuna contra la varicela estable formulación contiene estabilizadores, como la sacarosa, hidrolizado de gelatina porcina, fosfato, glutamato, y la urea, así como una viva atenuada del virus de la varicela (Oka / Merck) y residual de los componentes de MRC-5 células [1]. Hidrolizado de gelatina porcina es una de las principales proteínas y péptidos basados en componentes de la formulación final, así como un componente utilizado en el tratamiento de VZV (Oka / Merck) a granel intermedio [2]. El mecanismo exacto de gelatina mediada por la protección a los virus de la vacuna es desconocida. Se cree que la gelatina proporciona no covalentes y no vinculante de protección específicos para las partículas virales que aumenta su estabilidad. Además, hidrolizado de gelatina crea y mantiene la estructura deseable / aparición de una vacuna liofilizada pastel [2]. El actual proceso de fabricación de gelatina hidrolizada porcina rendimientos preparativos que consisten en una mezcla de fragmentos de proteínas de diferentes tamaños [3]. La hidrólisis se convierte de alto peso molecular gelatina (> 100000 Da) para bajo peso molecular gelatina (entre 2000 y 5000 Da) [4]. De bajo peso molecular y la gelatina es menos probable que estimular la gelatina de IgE específica de alto peso molecular gelatina en sujetos vacunados [5]. Actualmente, la incidencia de reacciones anafilácticas a los hidrolizados de gelatina porcina es muy baja (aproximadamente 1 caso por cada 2 millones de dosis) [4]. En contraste, el uso de la no hidrolizado de gelatina en formulaciones vacunales de la vacuna contra los encargados de japonés en el pasado dio lugar a una mayor incidencia de gelatina específicos de tipo inmediato reacciones de hipersensibilidad en sujetos vacunados en Japón [6 - 10].

La puesta en práctica de alternativas, bien definidos los sustitutos para los materiales biológicos de origen humano o animal en las formulaciones de vacunas es una tendencia deseable en la industria farmacéutica. Para apoyar este objetivo, humana recombinante gelatina, denominado FG-5001, se obtuvo mediante un sistema de expresión de levadura y una fermentación completamente definido y proceso de purificación (FibroGen, Inc, South San Francisco, CA). FG-5001 es una de bajo peso molecular humana secuencia a base de gelatina fragmento (8,5 kDa) que puede ser utilizado como un sustituto para animales derivados de material y se ha demostrado que funcionan como una alternativa eficaz en la estabilización de ingrediente vivas atenuadas vacuna contra la gripe [11 ].

En este estudio, FG-5001 fue evaluada como un posible reemplazo para el hidrolizado de gelatina porcina en un refrigerador-experimental estable formulación de la vacuna contra la varicela. VVZ (Oka / Merck) fue cosechado en dos formulaciones preparadas con un hidrolizado de gelatina porcina o FG-5001. El efecto estabilizador de FG-5001 por VVZ (Oka / Merck) durante la vacuna se evaluó liofilización. Por otra parte, el corto plazo, así como a largo plazo VZV (Oka / Merck) potencia la estabilidad en virtud del acelerado y en tiempo real de las condiciones de almacenamiento se evaluó en un estudio comparativo. VVZ (Oka / Merck) de potencia después de un cambio a corto plazo en virtud del estudio de estabilidad acelerada las condiciones (37 ° C durante 7 días) fue similar para ambos preparados de vacunas. Aún más importante, la vacuna contra el virus de pérdidas de potencia asociadas con el almacenamiento a largo plazo bajo condiciones aceleradas a 15 ° C durante 12 meses y en tiempo real de condiciones a -15 ° C y, a 2-8 º C durante 24 meses fueron similares para ambos hidrolizado - gelatina porcina y humana recombinante gelatina-estabilizado vacunas. Por lo tanto, humana recombinante gelatina, FG-5001, demostraron una capacidad similar para estabilizar los vivos atenuados VZV (Oka / Merck) en un refrigerador experimental de la vacuna contra la varicela estable si se compara con la preparación de vacunas formuladas con un hidrolizado de gelatina porcina.

Métodos
Preparación experimental de la varicela (Oka / Merck) viral graneles

Cultura frascos con VZV (Oka / Merck)-MRC5 las células infectadas se obtuvieron de la División de Manufactura de Merck (MMD, West Point, PA). El VZV (Oka / Merck), que contiene células MRC5 fueron cosechadas en dos formulaciones preparadas con un hidrolizado de gelatina porcina (SOL-U-PRO; Dynagel Inc, IL), o de 8,5 kD gelatina humana recombinante (FG-5001; Lote # 04AE001 , FibroGen, Inc, CA), y las cosechadas en una pequeña escala imitando el proceso actual de cerca procedimiento de fabricación para VVZ (Oka / Merck) a granel preparación. Ambos fueron procesados graneles aliquoted, colocado en un lote de nitrógeno líquido congelador (Kwik-Congelación sistema de congelación, AIRCO, NJ, EE.UU.), congelados y transferidos a -70 ° C. Un conjunto de pequeñas muestras de líquido congelado alícuotas (1,0 mL) se presentó para la placa de ensayo VZV análisis para determinar VZV (Oka / Merck) durante los cambios de potencia de procesamiento a granel para ambos, SOL-U-PRO-y FG-5001-que contienen, varicela graneles .

Preparación de experimental, refrigerador y estable muestras de la vacuna contra la varicela

Vacuna contra el virus de la varicela en directo (Oka / Merck) es un preparado liofilizado. Cuando este refrigerador-estable vacuna se reconstituye según las instrucciones, cada dosis de 0,5 ml contiene los siguientes: un mínimo de 1350 unidades formadoras de placa (PFU), de Oka / Merck del virus de la varicela, aproximadamente 18 mg de sacarosa, 8,9 mg de hidrolizado de gelatina, 3,6 mg de urea, 2,3 mg de cloruro de sodio, 0,36 mg de monosódico L-glutamato, 0,33 mg de fosfato sódico básica, 57 mcg de fosfato potásico monobásico, 57 mcg de cloruro de potasio. El producto también contiene componentes residuales de MRC-5 incluyendo las células del ADN, proteínas y cantidades traza de neomicina y bovina de suero de ternera de MRC-5 medios de cultivo. El producto no contiene ningún conservante [1].

Experimental, refrigerador y estable vacuna contra la varicela muestras que contengan cualquiera de los hidrolizados de gelatina porcina, humana recombinante o la gelatina, se prepararon en una pequeña escala imitando el procedimiento actual de cerca el proceso de fabricación de vacuna contra la varicela. En pocas palabras, alícuotas (40 ml) de SOL-U-PRO-y FG-5001-VZV estabilizado (Oka / Merck) fueron graneles descongelado rápidamente en un baño de agua (30 ° C), y luego diluido en sus respectivos gelatina que contienen formulaciones para un objetivo de potencia ≈ 4,4 log 10 ufp / mL. Final formulado a granel (FFB) alícuotas (0,7 ml) de las dos vacunas experimentales se llenaron en viales de vidrio, en parte tapón, colocado en un lote de nitrógeno líquido congelador y congelados. Estas muestras congeladas FFB se dividieron en dos grupos. El primer grupo fue transferida a -70 ° C el congelador y más tarde fue utilizado como control para determinar el VVZ (Oka / Merck) potencia el cambio después de liofilización. El segundo grupo de muestras fue transportado a la cámara de liofilización (Usifroid Lyophilizer Modelo SMH 101, Usifroid SA, Francia), y liofilizados. Después de liofilización, los viales de vacunas han sido objeto de inspección, sellados y colocados en las estaciones de estabilidad.

A corto plazo ya largo plazo de vacunas bajo estudio de estabilidad acelerada y en tiempo real de condiciones

Además de almacenamiento a -15 ° C y 2-8 ° C para examinar en tiempo real de condiciones, la estabilidad utilizadas para el almacenamiento se templado a 15 ° C y 37 ° C para examinar la vacuna potencia la estabilidad acelerada en virtud de condiciones. En pre-determinados puntos temporales (37 ° C durante 7 días, 15 ° C durante 3, 6, 9, 12 meses; 2-8 ° C y 15 ° C durante 3, 6, 9, 12, 24 meses) viales de vacuna se retiraron de las estaciones de estabilidad y almacenados a -70 ° C hasta el momento de presentación de VZV (Oka / Merck) el análisis de potencia. Ejemplo de viales de vacuna cada momento los puntos se analizaron junto con sus respectivas muestras de control que habían sido almacenados a -70 ° C. Además, tres frascos de muestra cada vez que el punto también se presentaron para el análisis de humedad de la estabilidad a largo plazo estudio ejecutado a 2-8 ° C durante 24 meses.

VVZ (Oka / Merck) el análisis de la placa de ensayo

VVZ (Oka / Merck) de potencia en ambas preparaciones a granel viral y la vacuna experimental muestras fueron determinados por VVZ placa de ensayo con líquidos de superposición de mediano [12]. Muestras analizadas (descongelados muestras líquidas a granel y líquida FFB vacuna muestras, así como vacuna liofilizada reconstituida muestras) se diluye con el estabilizador y presentado para su análisis en 1 × 12 formato de ensayo (una muestra en cada uno de los 12 corre independiente de ensayo). VVZ (Oka / Merck) la potencia se define como un registro de 10 VZV unidades formadoras de placa (PFU) por ml.

Análisis de contenido de humedad de muestras de vacuna liofilizada

La cantidad de humedad en la vacuna liofilizada muestras fue determinado por el coulometric Karl Fischer método de valoración [13] utilizando un Aquatest ™ coulometric sistema de valoración de humedad (Photovolt Instruments, Inc, Minneapolis, MN) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Para cada análisis, contenido medio de humedad (%) se calculó sobre la base de resultados válidos a partir de tres muestras a prueba la vacuna.

El análisis estadístico

La potencia asociada a las pérdidas de liofilización se calcula como el promedio de las diferencias observadas entre las muestras líquidas y los -70 ° C (liofilizado) muestras analizadas en el mismo ensayo de 12 carreras. El error estándar de estimación de la pérdida es simplemente la desviación estándar de las diferencias observadas dividido por la raíz cuadrada del número de carreras en que la diferencia se calculó. Lo mismo los cálculos se realizaron con la estabilidad de los datos de 37 ° C durante una semana. Dentro de ejecutar las diferencias entre los -70 ° C (liofilizado) muestras y los 37 ° C las muestras y se determinaron a través de un promedio de 12 carreras independientes. Los datos generados para la estabilidad a largo plazo consistía en la estimación de las pruebas de concurrentes "incubados" muestras (los almacenados a -15 ° C, 2-8 ° C, y 15 ° C para pre-especificado intervalo), junto con muestras de control de la misma mucho que sólo se almacena a -70 ° C. Para cada intervalo de estabilidad, 12 incubados y 12 viales de control viales se pusieron a prueba, un vial cada uno, en 12 carreras de ensayo independiente. La pérdida de potencia en ese intervalo se calculó como la diferencia media entre el control y se incuba la muestra dentro de cada plazo. Este formato ayuda a minimizar las posibilidades de correr a correr diferencias en el ensayo que afectan a la estabilidad de estimación. Para cada una de las dos formulaciones, análisis de regresión lineal se realizó a través de estimaciones de las pérdidas a largo plazo cada temperatura de almacenamiento.

Resultados
VVZ (Oka / Merck) potencia los cambios después de liofilización de vacunas contra la varicela experimental

VVZ-MRC5 células infectadas fueron cosechadas en dos estabilizadores que contengan cualquiera de SOL-U-PRO o FG-5001, en una pequeña escala-proceso que cerca imitado el procedimiento de fabricación para VVZ (Oka / Merck) graneles. Ambos, SOL-U-PRO y FG-5001-VZV estabilizado (Oka / Merck) fueron graneles más utilizados en la preparación experimental de nevera-vacunas contra la varicela estable. Estos experimental formulaciones de la vacuna contra la varicela se prepararon en una pequeña escala formulación, llenado, congelación, liofilización y procedimiento de cerca imitando el actual proceso de fabricación de vacuna contra la varicela. El VZV (Oka / Merck) las pérdidas de potencia asociadas con liofilización fueron similares para ambos experimental, hidrolizado de gelatina porcina-(0,79 log 10 PFU con un error estándar de ± 0.03) y la humana recombinante que contienen gelatina (0,70 log 10 PFU con un error estándar ± 0,06) las vacunas de varicela. Después de liofilización, los viales con la vacuna contra la varicela muestras se colocaron en las estaciones de estabilidad a corto plazo, así como a largo plazo la vacuna contra la varicela potencia estudios de estabilidad.

A corto plazo la estabilidad térmica estudio experimental de las vacunas de varicela en virtud del acelerado condiciones

El principal objetivo de este experimento fue evaluar el efecto de una gelatina humana recombinante, FG-5001, en el corto plazo la estabilidad de VZV (Oka / Merck) en potencia experimental, refrigerador y estable formulación de la vacuna contra la varicela en virtud del acelerado las condiciones (37 ° C durante 7 días) en un estudio comparativo con una vacuna formulada con SOL-U-PRO. Potencia similares se observaron cambios para ambas formulaciones vacunales, ya sea que contengan gelatina porcina (0,47 ± 0,03 log 10 PFU por 7 días) o gelatina humana recombinante (0,44 ± 0,07 log 10 PFU por 7 días), después de exposición de corta duración para el estrés térmico en 37 ° C durante 7 días. Por lo tanto, la sustitución de gelatina porcina humana recombinante con gelatina a base de producto no parece tener un efecto significativo (p = 0,49) en la estabilidad térmica de VZV (Oka / Merck) como se ha visto en este estudio. Por otra parte, la varicela, vacuna liofilizada formulaciones hechas en ambos gelatina preparativos demostrado un alto porcentaje de pasteles con una excelente integridad que se mantuvo incluso después de corto plazo la exposición a estrés térmico (datos no presentados).

La estabilidad a largo plazo bajo estudio acelerado y en tiempo real de condiciones

A raíz de liofilización, la vacuna muestras se colocaron en cámaras de estabilidad templado, a 2-8 º C y -15 º C durante un largo plazo (24 meses) en virtud del estudio de estabilidad en tiempo real de condiciones. Con el fin de evaluar VZV (Oka / Merck) potencia la estabilidad acelerada en virtud de condiciones, un conjunto de ambos tipos de vacuna muestras fueron también colocados en una cámara de estabilidad templado a 15 ° C durante 12 meses. El virus potencia pérdidas asociadas con el almacenamiento a largo plazo (log10 PFU pérdida por mes, modelo de regresión lineal), a 2-8 º C (Figura 1A], -15 ° C (Figura 1B], y 15 ° C (Fig. 1C], fueron similares para los dos hidrolizado de gelatina porcina y humana recombinante gelatina que contienen vacunas contra la varicela (p = 0,94, 0,87 y 0,97, respectivamente). El porcentaje de pérdida de las estimaciones para cada tipo de gelatina-estabilizado vacuna, así como una estimación combinada combinando los datos de ambas vacunas se enumeran en el cuadro 1. No hay diferencia estadísticamente significativa en la estabilidad de potencia se observó entre las formulaciones de vacunas almacenadas en cualquiera de las temperaturas de prueba. Durante el largo plazo de estudio (24 meses) en virtud del tiempo real las condiciones (2-8 ° C), el promedio de valores de contenido de humedad de hidrolizado de gelatina porcina-(2,33% ± 0,12 error estándar) humana recombinante y la gelatina que contienen (2,27% 0,07 ± std error) vacuna muestras fueron comparables (p = 0,68). No hay tendencia estadísticamente significativa en el contenido de humedad en el tiempo, a 2-8 º C se encontró, ya sea para la formulación (p> 0,05).

Discusión

Los experimentos más arriba se analizó la conveniencia de gelatina humana recombinante, FG-5001, como un sustituto de hidrolizado de gelatina porcina, SOL-U-PRO, a título experimental, refrigerador y estable vacuna contra la varicela preparación. En nuestro estudio, la vacuna contra los preparados que contengan cualquiera de SOL-U-PRO o FG-5001 demostrado comparable VZV (Oka / Merck) a corto plazo, así como a largo plazo potencia la estabilidad en virtud del acelerado y en tiempo real de condiciones. El análisis estadístico de VZV (Oka / Merck) durante los cambios de potencia la estabilidad a largo plazo bajo estudio en tiempo real las condiciones no mostró diferencias estadísticamente significativas en VZV potencia la estabilidad, ya sea para la formulación almacenados en cualquiera de las temperaturas de prueba. Además, FG-5001 realiza de manera similar a SOL-U-PRO cuando se utiliza como un componente de un proceso para generar grandes cantidades de virus, así como durante la preparación de una vacuna líquida formulación, llenado en viales, la congelación y liofilización.

En otro de corto plazo en virtud del estudio de estabilidad acelerada condiciones, Olsen et al. [11] demostraron que FG-5001 funcionó como un eficaz estabilizador de virus vivos, manteniendo el título de una viva atenuada contra la influenza cepa A / Sydney CAZ-002, así como un hidrolizado de gelatina (Kind & Knox Corporation, Sioux City, IA). Este estudio indica el único polipéptido que figura la plena actividad biológica de una venta en el comercio animales transformadas gelatina producto.

Hidrolizado de origen animal gelatinas son ampliamente utilizados en la industria farmacéutica como estabilizadores en las vacunas y otros productos biofarmacéuticos. El carácter heterogéneo de estas mezclas de proteínas crea un desafío con respecto a su caracterización analítica. La levadura de producción humana recombinante gelatina fragmento, FG-5001, es un producto definido de peso molecular y físico-químicas, y representa un nuevo biomaterial que anteriormente no disponible de fuentes animales [3].

Si bien la gelatina productores y usuarios finales han investigado una serie de naturales y sintéticos sustitutos de los de origen animal gelatina disponibles en la actualidad, un sustituto universal todavía no se ha encontrado. Por el contrario, la tecnología recombinante de la levadura puede proporcionar adecuados humanos gelatina a base de materiales que pueden ser altamente purificado y caracterizado plenamente. Estos genéticamente distintas moléculas potencialmente puede ser utilizado como una alternativa para sustituir hidrolizado de origen animal gelatinas y otros excipientes que actualmente se utilizan en una variedad de productos farmacéuticos. Aún más importante, esta nueva tecnología permite la producción de humana recombinante a base de gelatinas con pre-definidos peso molecular, punto isoeléctrico (PI), garantiza mucho-mucho reproducibilidad, y la capacidad de adaptar la molécula para que coincida con una determinada aplicación farmacéutica .

Agradecimientos

Los autores desean reconocer la contribución técnica a este trabajo proporcionada por Jeffrey Azul. Los autores también quisiera dar las gracias a Christine Lotz para la preparación de este manuscrito.