Kinetoplastid Biology and Disease, 2007; 6: 2-2 (más artículos en esta revista)

El inhibidor de proteinasa de cisteína Z-Phe-Ala-CHN 2 altera la morfología celular y la actividad de la división celular de Trypanosoma brucei torrente sanguíneo formas en vivo

BioMed Central
Stefan Scory (stefan.scory @ thermofisher.com) [1], York-Dieter Stierhof (york.stierhof @ zmbp.uni-tuebingen.de) [2], Conor R Caffrey (caffrey@cgl.ucsf.edu) [3 ], Dietmar Steverding (dsteverding@hotmail.com) [1]
[1] Abteilung Parasitologie, Hygiene-Institut der Ruprecht-Karls Universität, Im Neuenheimer Feld 324, 69120 Heidelberg, Alemania
[2] Abteilung Membranbiochemie, Max-Planck-Institut für Biologie, Corrensstraße 38, 72076 Tübingen, Alemania
[3] Abteilung Tropenhygiene und Öffentliches Gesundheitswesen, Hygiene-Institut der Ruprecht-Karls Universität, Im Neuenheimer Feld 324, 69120 Heidelberg, Alemania
[4] Zentrum für Molekularbiologie der Pflanzen, Eberhard-Karls-Universität, Auf der Morgenstelle 1, 72076 Tübingen, Alemania
[5] Sandler Centro de Investigación Básica en Enfermedades Parasitarias, California Instituto de Investigación Biomédica cuantitativos, Byers Hall, University of California San Francisco, 1700 4th Street, San Francisco, CA94158-2330, EE.UU.
[6] actual dirección: Centro de la Investigación Biomédica, Facultad de Medicina, las políticas y prácticas sanitarias, de la Universidad de East Anglia, Norwich NR4 7TJ, Reino Unido

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Resumen
Fondo

Actualidad quimioterapia de la tripanosomiasis humana africana o enfermedad del sueño se basa en fármacos desarrollados hace décadas, algunos de los cuales muestran efectos secundarios tóxicos. Una prometedora línea de investigación hacia el desarrollo de nuevos anti-trypanosomal drogas son pequeñas moléculas de los inhibidores de Trypanosoma brucei cisteína proteinasas.

Resultados

En este estudio, demuestran que el tratamiento de T. brucei ratones infectados con el inhibidor, carbobenzoxy-phenylalanyl-alanina-diazomethyl cetona (Z-Phe-Ala-CHN 2), altera la morfología de parásitos e inhibe la división celular. Tras diario intra-peritoneal administración de 250 mg kg -1 de Z-Phe-Ala-CHN 2 en los días tres y cuatro después de la infección (pi), stumpy-al igual que con las formas ampliada lisosomas se puso de manifiesto por cinco días pi Además, tripanosomas expuestos para el inhibidor tiene un 65% mayor contenido de proteína que los de ratones control. Además, en contraste con la normal el 16% de parásitos, con dos kinetoplasts - un rasgo distintivo de la mitosis activa, sólo el 4% de tripanosomas expuestos a los inhibidores de la división activamente, con indicación del ciclo celular de detención.

Conclusión

Le sugerimos que la inhibición de proteasas cisteína endógeno de Z-Phe-Ala-CHN 2 agota el parásito de nutrientes esenciales necesarios para la síntesis de ADN, lo que a su vez, impide la progresión del ciclo celular. Esta detención se desencadena la diferenciación de las consecuencias a largo delgado en corto stumpy formas.

Fondo

Trypanosoma brucei es el agente etiológico de trypanosomaisis africana humana o la enfermedad del sueño. En la actualidad sólo hay cuatro fármacos disponibles para el tratamiento de la enfermedad del sueño y algunos de estos inducir efectos secundarios graves [1]. Con esto en mente, investigaciones recientes han demostrado que los pequeños de inhibidores de moléculas de Clan CA cisteína proteinasas [2, 3] T. matar brucei in vitro y aliviar parasitiemia en modelos de ratón de la enfermedad [4 - 7]. Como posibles blancos de estos inhibidores, dos cisteína proteinasas han sido identificados. La primera, un ortholog de mamíferos catepsina B (tbcatB), es una sola copia de genes y expresada en tanto procíclico torrente sanguíneo y formas, pero con mayor niveles de ARNm detectable en la última etapa [8]. Hasta el momento, su sub-localización celular no está clara, pero puede ser, ya sea en el endosoma y / o lisosoma. Tetraciclina inducida por RNAi de tbcatB dado lugar a parásitos dismórficos conduce a la muerte celular [8], lo que plantea la posibilidad de que tbcatB puede ser un objetivo útil molecular de las enfermedades de intervención.

El segundo objetivo potencial de los inhibidores de proteinasa de cisteína, denominado trypanopain-TB [5], brucipain [6] o rhodesain [9], es un catepsina L-cisteína proteinasa como [10, 11] codificados por 11 copias de genes [12] y predominante en términos de actividad enzimática [9]. La inhibición de brucipain de la pequeña molécula inhibidora de carbobenzoxy-phenylalanyl-alanina-diazomethyl cetona (Z-Phe-Ala-CHN 2), en correlación con el compuesto de tripanocidas acción en vivo [4]. Por otra parte, este y otros inhibidores de peptidyl bloqueado proteinolysis en el lisosoma como lo demuestra la acumulación de undigested FITC-transferrina [4, 7], los datos de conformidad con la localización de lisosomales brucipain utilizando anticuerpos específicos [9, 13]. Brucipain se expresó de desarrollo, con aproximadamente cinco veces más proteína que se encuentra en corto stumpy formas que en cualquiera de largo-delgado o procíclico formas [9].

En este sentido, demostrar que Z-Phe-Ala-CHN 2 cuando se administró a ratones infectados con T. brucei resultados en parásitos con alterada la morfología celular, una disminución de la capacidad para degradar las proteínas intracelulares y la incapacidad de replicar mitotically. Se discuten estos resultados en relación con el parásito por las proteasas específicas Z-Phe-Ala-CHN 2.

Resultados

Para estudiar el efecto de Z-Phe-Ala-CHN 2 en la morfología celular y la división celular de la actividad sanguínea de forma tripanosomas en vivo, los ratones infectados con T. brucei fueron inyectados ip una vez al día en los días 3 y 4 pi con 250 mg kg -1 de los inhibidores de vehículo o en solitario. El día 5 pi, la sangre se prepararon frotis y los parásitos se aislaron de sangre infectada.

Para examinar la morfología celular de los parásitos por microscopía de luz, frotis de sangre fueron teñidas con May-Grünwald tinte. En la sangre de ratones de control, una población mixta de dividir a largo delgada de células y formas de detenidos a corto stumpy formas se encontró (Fig. 1b], con significativa (cuatro veces) más largo de formas delgadas. En contraste, la sangre de Z-Phe-Ala-CHN 2-ratones tratados figuran algunos de larga formas delgadas y casi todos los tripanosomas (> 90%) aparecieron como stumpy-como formas (Fig. 1a]. Además, una gran azul manchado región se observó entre los kinetoplast y el núcleo, es decir, en una posición acorde con el lisosoma (Fig. 1a]. Que este es el lisosoma se ve corroborada por el hecho de que la mayo-Grünwald tinte manchas ácidas componentes celulares. Long-delgado y corto stumpy formas de control de ratones no contiene esta estructura (Fig. 1b].

Al microscopio electrónico, tripanosomas de Z-Phe-Ala-CHN 2-ratones tratados eran considerablemente mayores que los de ratones control (Fig. 2]. Por otra parte, los lisosomas de tripanosomas expuestos a los inhibidores fueron significativamente mayores que los de corto stumpy formas de control de ratones (Fig. 2]. La ampliación del lisosoma también puede explicar por qué este orgánulo puede ser fácilmente observada por microscopía de luz después de mayo de Grünwald-tinción. Además, la mitocondria también fueron alargadas (Fig. 2].

A continuación, el contenido de proteína purificada de tripanosomas Z-Phe-Ala-2-CHN tratados de control de ratones y se comparó. Tripanosomas expuestos a los inhibidores había un 65% más proteína que los parásitos de los animales no tratados, los valores medios fueron 8,9 y 5,4 pg de células -1, respectivamente (Cuadro 1]. Así, observó microscópicamente la ampliación de tripanosomas expuestos a Z-Phe-Ala-CHN 2 correlacionado con un mayor contenido en proteínas de las células.

Para determinar el número de dividir las células, las gotas gruesas se colorearon con el ADN vinculante fluorocromo DAPI y examinadas por microscopía de fluorescencia. Tripanosomas se consideraron divisoria, si los parásitos contiene dos kinetoplasts. En contraste con el 16% de la población normal tripanosoma, con dos kinetoplasts, sólo el 4% de los parásitos expuestos a Z-Phe-Ala-CHN 2 fueron dividiendo (Cuadro 2]. Como la segregación de la kinetoplast precede trypanosomal citocinesis [14], este resultado indica que la división celular de tripanosomas se veía afectada bajo la influencia de Z-Phe-Ala-CHN 2.

Discusión

Anteriormente, hemos demostrado que los inhibidores de moléculas pequeñas de cisteína proteinasas matar T. brucei en la cultura y experimentalmente infectadas con ratones [4, 6]. Ahora que informe sobre el tratamiento de ratones infectados con el inhibidor de diazomethyl cetona, Z-Phe-Ala-CHN 2, parásito de muerte está precedida por un aumento en la celda de masa corporal y la ampliación de los elementos constitutivos organelos (mitocondria y el lisosoma), con un predominio (> ; El 90%) de tripanosomas que muestra una "stumpy-como" morfología. La hinchazón de la célula cuerpo antes de lisis celular se ha informado previamente de sangre formas de T. brucei y T. cruzi después de la incubación con peptidyl fluoromethyl cetonas in vitro [15]. El mecanismo propuesto implicados inhibición de la actividad cisteína proteinasa.

El tratamiento con Z-Phe-Ala-CHN 2 suscitó una notable ampliación del lisosoma de tripanosomas coincidente con la aparición del mismo organelo después de la tinción con May-Grünwald la solución. Esto sugiere que el inhibidor impide la normal proteólisis en el lisosoma lo que permite la acumulación de proteínas undegraded y el consiguiente aumento de peso parásito (Tabla 1]. La alteración en lisosomales tamaño y la función está en consonancia con la anterior conclusión de que co-incubación de cultivos de T. brucei torrente sanguíneo formas con Z-Phe-Ala-CHN 2 y FITC que llevan la etiqueta de transferrina impedido la degradación de estos últimos en el lisosoma [4]. Sin embargo, la falta de una mayor densidad de electrones en la ampliada lisosoma, como normalmente se espera a la acumulación de proteínas undegraded, puede sugerir un aumento de la permeabilidad del agua de los orgánulos.

Si bien es posible que formalmente Z-Phe-Ala-CHN 2 tripanocidas ejerce su acción a través de uno o más fuera de los mecanismos de meta, un objetivo molecular probable responsable de la ampliada lisosoma fenotipo es brucipain dado que es localizado en el lisosoma [9] y que la exposición a los inhibidores in vivo los resultados en una notable disminución (92%) a celulares de proteasa cisteína actividad, la mayoría de los cuales se debe a brucipain [4]. También es posible que el fenotipo es el resultado de la inhibición de tbcatb de Z-Phe-Ala-CHN 2, a pesar de que un sub-localización celular de esta enzima en consonancia con el fenotipo es aún desconocido [8]. Curiosamente, la tetraciclina inducida por RNAi de tbcatB, pero no brucipain, indujo un fenotipo letal precedida de una ampliada endosoma / lisosoma compartimento [8] similar a la que como consecuencia de la exposición a Z-Phe-Ala-CHN 2. Las conclusiones fueron que tbcatb, no brucipain, es esencial para T. brucei supervivencia y tbcatb que fue el objetivo más probable es que el inhibidor de [8]. Sin embargo, con respecto a brucipain, tanto de estas sentencias están abiertos a la reinterpretación dada la información disponible. En primer lugar, plenamente el 35% de rhodesain actividad se mantuvo en presencia de tetraciclina inducida por RNAi [8], posiblemente suficiente para permitir la función normal de las células y la falta de un claro fenotipo. Por lo tanto, todavía no está claro lo que un total de knock-down de brucipain podría rendimiento en términos de la capacidad del parásito para sobrevivir. En segundo lugar, Z-Phe-Ala-CHN 2 es reactivo químicamente con ambos mamíferos y cathepsins B L [16, 17] y no hay datos cuantitativos para sugerir que es preferentemente tbcatb inhibida por este compuesto. De hecho, se ha demostrado que, en T. brucei lisados, tanto brucipain y un 34 kDa proteinasa especies (en consonancia con el peso molecular de tbcatb) son inhibidas por la Z-Phe-Ala-CHN 2 [9].

Para otros protozoos parásitos, aberraciones morfológicas, en consonancia con la prevención de proteinolysis normal, se han observado, previa solicitud de los inhibidores de la cisteína proteinasa. Por lo tanto, la incubación de T. cruzi epimastigotes con el inhibidor de proteinasa de cisteína morpholinourea-phenylalany-fenil homophenylalanine vinylsulfone (K11777) llevó a ampliada organelos intracelulares (retículo endoplasmatic, membrana nuclear, mitocondria) y alteraciones morfológicas del complejo de Golgi [18]. Del mismo modo, por Plasmodium falciparum trofozoítos, los inhibidores de la cisteína proteinasa alterado la morfología de la vacuola alimentaria y ha impedido la degradación de la hemoglobina [19, 20].

Además de los cambios morfológicos, los "stumpy-como" la naturaleza de tripanosomas expuestos a Z-Phe-Ala-CHN 2 fue justificado por el escaso número de dividir los parásitos. Sólo el 4% de los parásitos se multiplican que está cerca de la divisoria número de células (a largo formas delgadas) de alrededor del 2% se encuentran en corto natural enriquecido stumpy poblaciones en vivo [21]. Debido a que hemos detectado ningún aumento en las células multinucleadas con aberrantes kinetoplast / configuraciones de núcleo, como puede ocurrir en ausencia de las condiciones fisiológicas [22, 23], el bajo número de dividir las células indica Z-Phe-Ala-CHN 2 induce una detención del ciclo celular.

Transformación de largo delgado en las formas "stumpy-como" formas se ha observado previamente a tratamiento con la methylating agente 1,2-bis (methylsulfonyl)-1-methylhydrazine y la ornitina descarboxilasa inhibidor de DL-α-difluoromethylornithine (DFMO) [ 22, 24, 25]. Considerando que el principal efecto de DFMO es el agotamiento de la piscina polyamine intracelular, que de 1,2-bis (methylsulfonyl)-1-methylhydrazine es la modificación del ADN. Sin embargo, el efecto posterior de ambos agentes es una inhibición de la síntesis de ADN que a su vez conduce a la detención del ciclo celular [22, 25]. Un mecanismo similar puede también cuenta para la detención del ciclo celular en tripanosomas expuestos a Z-Phe-Ala-CHN 2: inhibición de la proteólisis lisosomales agota el parásito de los nutrientes necesarios para la síntesis de ADN y esto es seguido por el bloqueo de la mitosis. La celda de detención del ciclo también puede explicar la razón por la Z-Phe-Ala-2-CHN expuestos tripanosomas son 65% más grande que el control de parásitos a medida que siga creciendo, pero han dejado de dividir.

Conclusión

Este estudio ha demostrado que el tratamiento de T. brucei ratones infectados con el inhibidor de proteinasa de cisteína Z-Phe-Ala-CHN 2 da como resultado un mayor número de detenidos-mitotically, stumpy forma-como los parásitos. Los resultados de acuerdo con las sugerencias anteriores que aplican la detención del ciclo celular pueden desencadenar delgado-a-stumpy diferenciación [21].

Materiales y métodos
Reactivos

Z-Phe-Ala-CHN 2 fue adquirido de Bachem, Heidelberg, Alemania; mayo-Grünwald tinción de solución se obtuvo de Merck, Darmstadt, Alemania; 4,6-diamidino-2-phenylinodole (DAPI) fue comprado de Sigma, Deisenhofen, Alemania; BCA Proteína de ensayo fue de Pierce Chemical Company (Rockford, IL, EE.UU.).

Tratamiento de T. brucei ratones infectados con Z-Phe-Ala-CHN 2

Mujeres ratones BALB / c (aproximadamente 10 semanas de edad) estaban infectados por vía intraperitoneal (ip) con 2 × 10 4 células de la pleomórfico T. brucei variante clon AnTat 1,1 [26]. En los días 3 y 4 después de la infección (pi) los ratones fueron tratados una vez al día con ip inyecciones de 250 mg kg -1 de Z-Phe-Ala-CHN 2 disuelto en el 70% DMSO/30% NaCl solución fisiológica. Control de ratones infectados recibieron sólo el vehículo. El día 5 pi, la sangre se prepararon frotis o parásitos fueron purificados a partir de sangre de DEAE-celulosa cromatografía [27].

La tinción de frotis de sangre

Frotis de sangre fueron teñidas con May-Grünwald tinción de solución y, además, tratados con 0.0001% DAPI a la etiqueta y el núcleo kinetoplast. El manchado diapositivas fueron examinados bajo el microscopio (Axioplan) mediante un Plan 100X-Neofluar objetivo la transmisión y fluorescencia de la luz.

Microscopía electrónica

Purificada tripanosomas fueron fijadas en el 2% de glutaraldehído formaldehyde/0.05% en PBS por 60 min. Después de la inserción en el 1% de agarosa, las células fueron post-fijadas con 1% osmio tetraoxide/0.9 ferricianuro% en PBS durante 60 min seguido de un 1% de acetato de uranilo para 60 min. Las células fueron deshidratados en etanol y posteriormente incorporados en resina epoxi. Ultrathin fueron teñidos con acetato de uranilo y citrato de plomo, y examinó con un Philips 201 microscopio electrónico a 60 kV.

Proteínas de ensayo

El contenido en proteínas de tripanosomas se determinó usando el ácido bicinchoninic (BCA) método. Zadas tripanosomas (2,5 - 3,7 × 10 5 células en 10 μ l) fueron incubadas con 200 μ l de BCA Protein reactivo de ensayo a 37 ° C. Una serie de diluciones de BSA (0,1 - 0,9 mg ml -1) se utilizó para generar una curva estándar y cada dilución fue creado por duplicado. Después de 30 min de incubación, la absorbancia a 500 nm se determinó usando un ELISA Dynatech MR5000 lector.

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no tienen intereses en competencia.

Autores de las contribuciones

SS, Y.-DS, DS y CRC lleva a cabo el trabajo experimental. DS concibe el estudio y supervisado su ejecución. CRC DS y preparó el borrador final del manuscrito. Todos los autores han leído y aprobado el manuscrito final.

Agradecimientos

Esta obra fue financiada en parte por el Bundesministerium für Forschung und Tecnología, Schwerpunkt für tropenmedizische Forschung en Heidelberg (01 KA 9301 / 3).