Neural Development, 2007; 2: 5-5 (más artículos en esta revista)

El antagonismo entre Notch y la proteína morfogenética ósea del receptor de señalización regula la neurogénesis en el labio cerebelosa rhombic

BioMed Central
Robert P Machold (machold@saturn.med.nyu.edu) [1], Deborah Jones Kittell (kittell@saturn.med.nyu.edu) [2], Gordon J Fishell (fishell@saturn.med.nyu.edu) [2]
[1] New York University School of Medicine Smilow Programa de Neurociencia Departamento de otorrinolaringología 522 Primera Avenida de Nueva York, NY 10016, EE.UU.
[2] New York University School of Medicine Smilow Programa de Neurociencia Departamento de Biología Celular 522 Primera Avenida de Nueva York, NY 10016, EE.UU.

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Resumen
Fondo

Durante el desarrollo embrionario del cerebelo, las neuronas se producen a partir de células progenitoras ubicadas a lo largo de una zona ventricular en rhombomere dorsal 1 que se extiende caudalmente a la placa del techo del cuarto ventrículo. La aposición del caudal neuroepithelium y techo de placa resultados en un único inductivo denomina la región cerebelar rhombic labio, lo que da lugar a gránulo de células precursoras y otros linajes glutamatérgica neuronal. Recientemente, nosotros y otros han demostrado que, en las primeras etapas embrionarias antes de la aparición de gránulo de células precursoras (E12), las olas de neurogénesis en el labio cerebelosa rhombic producir núcleos específicos hindbrain seguida de profunda cerebelosa neuronas. ¿Cómo la inducción de rhombic labio derivados de las neuronas de cerebelo progenitores se regula en esta fase de desarrollo cerebelosa para producir estas temporalmente discretos poblaciones neuronales, mientras que el mantenimiento de una piscina progenitoras para su posterior neurogénesis no se conoce.

Resultados

El empleo de ambos de ganar y la pérdida de función de los métodos, nos encontramos con que Notch1 señalización en el primordio cerebelosa regula la capacidad de respuesta de las células progenitoras a las proteínas morfogenética ósea (BMP) secretada por el tejado placa que estimulan la producción de rhombic labio derivados de las neuronas. A falta de Notch1, cerebelosa progenitores están agotadas durante los primeros hindbrain producción de neuronas, lo que resulta en una severa disminución en las profundidades cerebelosa núcleos que normalmente se nacidos con posterioridad. Mecánica, nos demuestran que la actividad Notch1 evita la inducción de Math1 de antagonizar los receptores BMP-vía de señalización a nivel de Msx2 expresión.

Conclusión

Nuestros resultados ofrecen un mecanismo por el cual un equilibrio entre neural inducción y el mantenimiento de los progenitores neurales se realiza en el labio rhombic en todo el desarrollo embrionario.

Fondo

Los mamíferos cerebelo se desarrolla a partir de progenitores neurales en rhombomere dorsal 1 (r1) acaba de caudal a mediados de los hindbrain frontera y por encima de la apertura del cuarto ventrículo. En el cerebro de embriones de ratón, el cierre del tubo neural de embriones en torno a 9,5 días (E9.5) en general, crea una zona ventricular de progenitores neuronales que dan lugar a olas sucesivas de la diferenciación de las neuronas, sin embargo, en la apertura del cuarto ventrículo la neuroepithelium se extiende directamente a la placa de techo, lo que resulta en una ventaja a lo largo de la cerebelosa y hindbrain placa neural (r1-r8) denomina la rhombic labio. Situado en el límite caudal del cerebelo en Anlage dorsal r1, el cerebelo rhombic labio es un territorio único germinal que da lugar a células gránulo y otras neuronas del cerebelo y hindbrain [1 - 4].

Inmediatamente después de cierre del tubo neural, la expresión del ratón atonal homólogo Math1 [5], una base hélice-loop-hélice (bHLH) factor de transcripción que es necesaria para que el gránulo linaje de células y otros derivados rhombic labio poblaciones neuronales [6 - 8] , Comienza a ser inducido en el labio rhombic células que posteriormente emigran fuera de la rhombic labio rostrally sobre la superficie dorsal de la cerebelosa Anlage [9 - 11]. El techo de chapa se necesita para estos eventos [12 - 14], y es una fuente de proteína morfogenética ósea (BMP), miembros de la familia que han demostrado ser suficiente para inducir cerebelosa progenitores para expresar Math1 in vitro [15]. Por otra parte, los embriones de ratón que carecen de expresión del receptor de BMP en el tubo neural perder Math1 expresión en el labio rhombic [16], lo que indica un papel crucial para la señalización de BMP en el curso de inducción de Math1 durante rhombic labio neurogénesis.

Una variedad de enfoques suerte de cartografía han llevado a la conclusión de que el cerebelo rhombic labio produce temporalmente distintas poblaciones neuronales durante la embriogénesis [11, 17, 18]. Recientemente, hemos generado un destino temporal mapa de la Math1 células del cerebelo rhombic labio, usando la transgénesis en ratones para la etiqueta cohortes de Math1 células de expresar una recombinación Cre inducible (CREER T2) bajo el control de la Math1 potenciador. Nosotros y otros han informado de que, antes de la aparición de gránulo de células precursoras, los cerebelosa rhombic labio es el origen germinal de hindbrain específico y profundo cerebelosa neuronas [7, 8]. En este sentido, proponemos que, a lo largo de la temporada alta de la neurogénesis en el labio rhombic (E9.5 a E16.5), está en marcha un BMP-mediada por la inducción de Math1 en cerebelosa progenitores que produce ondas de distintas poblaciones neuronales a través del tiempo. Tanto la presencia de genes Notch sensible en esta región [19] y la observación de que Notch puede antagonizar BMP señalización en otros tipos de células neuronales [20] indican que la vía Notch puede regular este proceso. Utilizando tanto la pérdida y ganancia de función de criterios, demostrar que una interacción antagónica entre Notch y de señalización del receptor de BMP en cerebelosa progenitores regula su mantenimiento y la diferenciación dentro de la rhombic labio en todo el desarrollo embrionario.

Resultados
Pérdida de Notch1 en el primordio cerebelosa rhombic labios aumenta la neurogénesis

Notch1 ARNm se expresa en el primordio cerebelosa tan pronto como E9 (datos no presentados), y por E12.5 se limita a progenitores neurales en la zona ventricular (VZ) (Figura 1]. BMP actividad en el labio y rhombic caudal VZ se desprende de la expresión de Msx2, un factor de transcripción del homeodominio que ha demostrado ser un objetivo de BMP señalización [21]. Tenga en cuenta que el patrón de expresión de Msx2 se superpone con la expresión de Math1 en esta fase embrionaria (Figura 1]. Expresión de la bHLH factor de transcripción Mash1 [22] probable delinea los precursores de las células de Purkinje y de otras neuronas GABAérgicas cerebelosa que se deriven de la zona ventricular [19, 23]. Dentro de la VZ, Hes5 expresión refleja la actividad de señalización Notch en la piscina cerebelosa progenitoras, mientras que la expresión puntiforme de Delta1 probablemente indica una subpoblación de los precursores neuronales que están en la diferenciación.

En una primera prueba para el requisito de la señalización Notch en la regulación de rhombic labio inducción neural, hemos examinado si la pérdida de actividad de Notch en cerebelosa progenitores puedan dar lugar a un aumento de la neurogénesis rhombic labio, medido por Math1 expresión. Para eludir los primeros (E10) letalidad de Notch1 null embriones [24], que cruzaron ratones con un alelo nulo condicional de Notch1 [25] en el que el primer exon del gen Notch1 ha sido flanqueado por sitios loxP ( 'floxNotch1') con ratones expresando cre recombinado bajo el control de la Engrailed-1 gen (En1cre) [26]. Como se muestra de β-galactosidasa en una tinción Rosa26 stop-lacZ de fondo [27], Engrailed-1 dirige la expresión de la cre recombinado ampliamente entre mediados de los hindbrain región de E9.5 (figura 2a]. Por E10.5, no hay ARNm detectable Notch1 restantes en el cerebelo primordio de la mutante condicional, a diferencia de tipo salvaje littermates (Figura 2b, c], con la excepción del lateral más territorio, donde la recombinación es incompleta (datos no se muestra). Pérdida de Notch1 no tienen un efecto ostensible en isthmic techo o placa de marcadores en esta etapa (de ficheros adicionales 1]. Tanto de los mRNAs de la bHLH factores de transcripción Mash1 y Math1 se expresan en niveles más altos en los embriones mutantes, pero en un complemento de distribución: Mash1 expresión es el aumento en el primordio cerebelar rostral (Figura 2d, e], mientras que hay un sólido aumento de la Math1 expresión proximal a la rhombic labio en comparación con los de tipo salvaje littermates (Figura 2f, g]. Este aumento de la expresión Math1 es evidente en el nivel de proteína y (Figura 2 h, i], y parece reflejar un aumento en ambos el número de células, así como los niveles de expresión de Math1 en la diferenciación inducida por las células.

Por E12.5, los embriones mutantes muestran una marcada disminución en el tamaño de la cerebelosa primordio en comparación con los de tipo salvaje littermates. Sin embargo, no evidente aumento en la muerte celular (Terminal Deoxynucleotidyl Transferase mediada por dUTP nick de fin de etiquetado, de ficheros adicionales 2, o la caspasa-3 inmunohistoquímica), o la disminución de la proliferación (a corto plazo la incorporación bromodeoxyuridine) residual en la zona cerebelosa ventricular se observó en esta etapa (datos no presentados). Tras la upregulation de Mash1 a los mutantes en E10.5 (Figura 2d, e], Mash1 expresión se reduce en todos pero el más rostral territorio de la zona ventricular en comparación a su forma natural a E12.5 (Figura 2L, m]. Por el contrario, un aumento de Math1 expresión es todavía evidente en las E12.5 mutantes, y dispersos Math1 + células se observan en una esfera más amplia de la zona ventricular en comparación con las secciones de tipo salvaje littermates al mismo medial de posición lateral (entre paréntesis en la figura 2n, o]. Este patrón de expresión Math1 en el mutante se asemeja a la observada en la mayoría de las secciones medial de tipo salvaje animales, donde el primordio cerebelosa es más delgado y una mayor cercanía a la línea media y techo de chapa. El aumento en subpial distribución de Math1 + células mutantes en el podría ser atribuible a un aumento en la tasa de migración fuera de la rhombic labio, lo cual es coherente con la observación de que la actividad Math1 se requiere para subpial migración de las neuronas rhombic labio [6, 28 ].

El aumento de Math1 expresión y concomitante disminución en Mash1 de E10.5 a E12.5 en los mutantes sugiere que la pérdida temprana de Notch1 se traduce en un aumento en los labios rhombic neurogénesis a expensas de mantener la zona ventricular progenitoras piscina. En consonancia con esto, por E16.5, el mutante cerebelo es muy reducido en tamaño en comparación con el tipo salvaje (Figura 3a-d], y hay una grave disminución de los precursores de células de Purkinje (calbindin inmunoticción) que normalmente se genera a partir de la ventricular zona en torno a principios E12 (Figura 3e, f]. En contraste con los resultados presentados en un estudio anterior sobre el EN2-Cre; floxNotch1 ratón mutante [19], lo hicimos no se observó postnatal supervivencia de los embriones mutantes, e incluso de E18.5 no hay aparente recuperación de los mutantes en el cerebelo términos de tamaño o morfología (datos no presentados). La mayor gravedad de fenotipo en nuestro estudio más probable es que el resultado de una más completa pérdida de Notch1 en el cerebelo mediante el primordio En1-cre-a golpe de ratón que se obtuvo en el cre-EN2; floxNotch1 mutante.

Anteriormente, nosotros y otros han encontrado que las primeras Math1 rhombic labio precursores neuronales dan lugar a determinados núcleos hindbrain y la profunda cerebelosa núcleos (DCN) [7, 8], con el pico de producción de esta última se producen alrededor de E11.5, lo que sugiere que estos las neuronas se generan después de la mayoría de hindbrain neuronas se han producido (E9.5 a E11.5). Para obtener un destino a corto plazo mapa de la Math1 + células que se plantean en el En1cre; floxNotch mutante cerebelo, que generó este mutante condicional en un Math1-lacZ knock-(+/-) a fondo [29] y se analizaron los residuales β - galactosidasa manchas presentes en el labio rhombic linajes en las secciones coronal en E14.5. Sorprendentemente, mientras que se observó en general comparables número de rhombic labio derivados de β-gal + hindbrain neuronas que, en conjunto, incluir la mesopontine tegmental (MPT), parabigeminal (PBG), lateral lemniscus (LL), y el lateral parabrachial (LPB) de las neuronas a rostral caudal posiciones (figura 4a-d, a largo flechas), se observó una disminución dramática en DCN (corto flechas). Las neuronas de la LPB que se derivan de un precursor Math1 + Se ha demostrado que expresar calbindin embryonically [8] y, curiosamente, se observó un aumento en calbindin manchas en la mutante (Figura 4e, f, flechas blancas). Este resultado sugiere que, a falta de Notch1 actividad, a principios específicos derivados rhombic labio linajes se generan en exceso a expensas de los núcleos hindbrain DCN y que se especifican un poco más tarde.

Sorprendentemente, también observó que el gránulo de células precursoras adecuadas (PCA), un labio rhombic derivados población especificado después de la DCN, parecen ser generado en cierta medida en los mutantes, aunque hay una marcada disminución de caudal regiones (Figura 4c, d]. La persistencia de granulado en las células mutantes puede reflejar el hecho de que, mientras que el conductor En1cre se utilizan en estos experimentos recombina la gran mayoría de los mes/r1 primordio, la mayoría de las regiones laterales de la cerebelosa primordio escapar recombinación (datos no presentados). Por lo tanto, es posible que algunas células gránulo se generan migrar lateralmente y mediáticamente para poblar la rostral gránulo capa exterior (EGL). Por otra parte, tal como se describe en mayor profundidad más adelante, puede haber distintas linaje restringida piscinas de rhombic labio progenitores que se mantienen independientemente de Notch actividad hasta que comienzan a dividir asimétricamente para producir las neuronas.

El nivel de actividad de Notch en cerebelosa progenitores de células regula su destino

Si la pérdida de Notch1 aumenta la capacidad de respuesta de los progenitores cerebelosa a las señales inductivas que directa rhombic labio neurogénesis, entonces la expresión de ligandos de Notch (por ejemplo, Delta) también deben hacer las células más receptivos a estas señales de desarrollo en virtud de la inhibición lateral [30]. Para probar esta hipótesis directamente, que generó un pseudotyped bicistronic retrovirus que expresa toda su longitud Delta1, junto con la placenta humana fosfatasa alcalina (PLAP), para permitir la detección histoquímica de células transfectadas. Aproximadamente el 10 6 viriones se inyecta en el ventrículo de E9.5 a E10 embriones en el útero mediante ecografía backscatter microscopía [31], y la eliminación de los animales analizados tres semanas después del nacimiento. Figura 5a muestra los resultados de las inyecciones de control de un retrovirus que expresan sólo PLAP analizados en P21 de la fosfatasa alcalina histoquímica. Las células infectadas estaban presentes en todos los compartimentos de la madurez del cerebelo y no muestran un evidente sesgo hacia un determinado tipo de células. Sorprendentemente, de forma similar con las inyecciones de retrovirus que expresa toda su longitud Delta1 (Figura 5b] se debieron a la rotulación de gránulo predominantemente células, como se observa por la posición, morfología (nota PLAP la tinción de fibras paralelas en la capa molecular), inmunohistoquímica y co-etiquetado con anticuerpos contra Zic2 (verde) [32] y PLAP (rojo; Figura 5e cuadro). Por otra parte, Delta1 infecciones en esta etapa también parece contribuir a la DCN (flecha blanca). Dado que estos retrovirus requieren aproximadamente 24 horas para integrar y expresar las proteínas Delta1, sugerimos que estas células infectadas Delta fueron diferenciando y expresando Math1 en torno al E11.5 a E12 y, por tanto, contribuido a la DCN y principios especificados (anterior) que se GCP producen normalmente en ese momento.

Para examinar el efecto de la activación constitutiva Notch en cerebelosa progenitores, se realizó inyecciones con un retrovirus que expresa el dominio intracelular del receptor Notch (muesca CIE), que es conocido por resultado ligando independiente a la activación de la vía de señalización Notch [33]. Inyecciones de Notch1 CIE expresar retrovirus en E9.5 dado lugar a las células infectadas en desarrollo principalmente en Bergmann neuroglia radial (Figura 5c], como se indica por su morfología radial e inmunohistoquímico co-etiquetado con cerebro de lípidos-proteína de unión (BLBP; rojo) [34] y PLAP (verde; Figura 5f cuadro). Estos ganancia de función experimentos demuestran que la actividad constitutiva Notch en cerebelosa progenitores evita que estas células de los países en desarrollo como rhombic labio derivados. Aunque varios informes recientes han descrito un papel de la señalización Notch en Math1 + linajes después de su especificación [35, 36], nuestros resultados sostienen que, en esos contextos, de señalización Notch debe regularse de forma dinámica de tal forma que las fases posteriores de diferenciación puede ocurrir .

Notch1 BMP inhibe la actividad de señalización a nivel de MSX1 / 2 expresión

Mientras tanto Notch y BMP actividades han demostrado ser crucial durante el desarrollo embrionario cerebelosa, cómo estas vías de señalización interactuar en este contexto es desconocido. Para explorar el mecanismo por el cual Notch1 señalización en el primordio cerebelosa antagoniza la inducción de rhombic labio neurogénesis en células progenitoras de señalización de BMP, optamos por utilizar el pollo en ovo sistema de electroporación, que es muy adecuado para obtener a corto plazo de funcionar con plásmidos múltiples expresión [37]. Etapa HH 10-12 embriones de pollo [38] se electroporated a mediados de los hindbrain frontera con diversas construcciones de expresión junto con una proteína verde fluorescente (GFP) reportero plásmido, y se analizaron dos días más tarde por hibridación in situ en cryosections del primordio de cerebelosa cambios en la expresión de la gallina Math1 homólogo Cath1 (Figura 6]. Para probar si la actividad ectópica BMP podría inducir Cath1 expresión, electroporated constitutivamente una forma activa de los receptores BMP 1b (caBMPR) a un nivel suficiente para inducir cambios de patrones pero no la muerte celular [39, 40]. Mientras que un control de la electroporación de un plásmido reportero GFP por sí solo no inducir Cath1 expresión (Figura 6 bis, b], ectópico activación de la vía de señalización de BMP en el primordio cerebelosa (frustradas círculo) dio lugar a una sólida inducción de la expresión Cath1 a lo largo de la superficie dorsal de el cerebelo Anlage (Figura 6c, d]. Curiosamente, cuando el Notch1 CIE fue co-electroporated junto con la expresión caBMPR plásmido en la zona ventricular cerebelosa, la inducción ectópica de Cath1 fue suprimida (Figura 6e, f; de ficheros adicionales 3]. Así, aunque la zona ventricular progenitores son competentes para responder a BMP señalización y expresar Cath1, se les impide hacerlo por los altos niveles de actividad de Notch.

La observación de que la actividad de Notch puede bloquear la inducción de Cath1 señalización de BMP en cerebelosa progenitores nos llevó a tratar de determinar a qué nivel estas vías se entrecruzan dentro de la célula. Electroporations de pollo en cerebelosa primordios de caBMPR solo o caBMPR y Notch1 CIE se colorearon mediante técnicas de inmunohistoquímica para fosforilados Smad1, una lectura directa de los receptores BMP señalización actividad [41]. Smad1 es un factor de transcripción que, tras la fosforilación de la serina del receptor de BMP / treonina quinasa actividad, forma un heterodimer con Smad4 y translocates al núcleo para activar la transcripción de genes blanco (por ejemplo, MSX1 / 2; Figura 6h] [42]. Como se muestra en la Figura 6, los niveles de Smad1 fosforilados estaban elevadas en ambos caBMPR (Figura 6i] y caBMPR/Notch1 CIE (Figura 6k] electroporated tejido, lo que demuestra que la expresión de Notch CIE no interferir en esta fase de la vía de señalización BMP . Sin embargo, mientras que la electroporación de caBMPR en el primordio cerebelosa (frustradas oval) dio lugar a la expresión ectópica de MSX1 / 2 en la zona ventricular (Figura 6J], esta inducción fue suprimida cuando Notch1 CIE fue co-electroporated (Figura 6L]. Condes de GFP + / MSX1 / 2 + en las células ventriculares zona de caBMPR y caBMPR/Notch1 CIE electroporated cerebella de tres embriones cada una se muestran en el gráfico e indican que, mientras que aproximadamente el 80% de las células ventriculares zona transduced con caBMPR expresar MSX1 / 2, este porcentaje se reduce a alrededor del 10% cuando Notch1 CIE es co-transduced. De este modo, la expresión de Notch1 CIE BMP antagoniza la vía de señalización a nivel de MSX1 / 2 de expresión.

Discusión

Hemos examinado las primeras etapas de desarrollo cerebelosa para obtener una comprensión de cómo la neurogénesis en el labio rhombic está regulada en toda la embriogénesis. Nos parece que la señalización Notch es fundamental para controlar el momento de la inducción de rhombic labio neuronas de la cerebelosa progenitoras piscina, así como para el mantenimiento de una población de progenitores para su posterior olas de neurogénesis. Uso in vivo ganancia de función de los métodos, que indican que la diferenciación neuronal del cerebelo progenitores puede ser inhibida por la activación constitutiva de la vía de señalización Notch1 durante la embriogénesis temprana, y que las células autónomas downregulation de Notch a través de la actividad de expresión de Delta1 en las primeras etapas embrionarias (E11.5) aumenta la capacidad de respuesta de las células a diferenciarse como neuronas rhombic labio. Por otra parte, nos encontramos con que la activación de la vía de señalización BMP pueden inducir la rhombic labio proneural gen Math1 ectópica ventricular en la zona, y que la activación simultánea de la vía Notch bloques de este efecto inductor en el nivel de expresión MSX. Por lo tanto, proponemos que el antagonismo entre la muesca y BMP vías de señalización regula la diferenciación de los progenitores cerebelosa durante todo el período de neurogénesis en el labio rhombic.

Nosotros y otros han demostrado recientemente que exista un curso de inducción de Math1 en el cerebelo rhombic labio que produce distintas poblaciones de neuronas en el tiempo, aquí, nos encontramos con que este proceso inductivo se rige por las interacciones entre la muesca y BMP vías de señalización. Sin embargo, en la actualidad poco se sabe sobre la cerebelosa progenitores que dan lugar a rhombic labio Math1 + linajes, y si se componen de una serie de linaje de poblaciones progenitoras restringidas o un solo grupo de progenitores. Anterior trabajo de nuestro laboratorio y otros sugiere que las células progenitoras neurales en la zona ventricular son heterogéneos [43 - 45], y que, si bien en las primeras etapas embrionarias progenitoras algunos linajes se mantienen por simétrico no neurogénica divisiones, mientras que otros se están convirtiendo en neurogénica y dividen asimétricamente para producir la diferenciación de las neuronas. Parece probable que la señalización Notch es particularmente crítico en el mantenimiento de un linaje progenitoras durante las divisiones celulares asimétricas. En este contexto, nuestro destino resultados de los mapas se muestra en la Figura 4 puede indicar que hay múltiples Math1 negativo progenitoras linajes dentro de la población cerebelosa progenitoras que dan lugar a neuronas rhombic labio. Si bien el número total de neuronas hindbrain (PBG, MPT, LPB) se especifica que parece ser relativamente poco afectada por la pérdida de Notch1, el gas licuado de neuronas parecen ser aumentado en número a expensas de la MPT neuronas y DCN, lo que sugiere que estos rhombic labio derivados las neuronas pueden surgir de un progenitor común linaje. La persistencia de GCPs en este experimento puede reflejar que hay una población de progenitores para GCPs que se mantiene independiente de Notch actividad durante la producción de hindbrain DCN y hasta la especificación de GCPs comienza. Esta posibilidad podría representar para la observación de que sólo los nacidos prematuramente (rostral) GCPs parecen ser especificado en el Notch1 mutante condicional, en que la señalización Notch se verían obligados a mantener la piscina GCP progenitoras durante el período de inducción BPC, y por lo tanto, estos progenitores sería rápidamente agotado por la falta de actividad de Notch. Por otra parte, los GCPs que se observan puedan haber surgido de la mayoría de las regiones laterales de la cerebelosa primordio que no son recombinados por el Cre-En1 conductor ya que estas células (pero no DCN) se sabe que migran de lateral para medial posiciones [46].

La función de señalización de BMP en la inducción neural se ha estudiado en muchos contextos, como la lucha contra la neurogénica papel de la señalización Notch. Sin embargo, poco se conoce en la actualidad acerca de cómo estas dos vías de interacción in vivo para regular la neurogénesis. Un reciente estudio sobre la determinación de células suerte en la cresta neural derivados demostrado un efecto dominante de activación de Notch en la prevención de la diferenciación neuronal en respuesta a BMP señalización in vitro [20]. En este estudio, se comprobó que la activación transitoria de Notch en la cresta neural progenitores dado lugar a una suerte gliogenic permanente cambio. En el contexto del cerebelo, tanto Notch y señalización de BMP se ha demostrado que regular la neurogénesis, pero no está claro que estas vías de señalización interactuar de la misma manera como se observa en la cresta neural. Nos parece poco probable que cerebelosa progenitores que se mantienen en la zona ventricular a través de señalización Notch se han comprometido exclusivamente a una suerte gliales. Por el contrario, en esta etapa de maduración de los progenitores, señalización Notch actúa para inhibir la respuesta a la señalización de BMP, pero no es en sí instructivo hasta más tarde etapas de desarrollo.

Nuestros datos que demuestren que la muesca y BMP vías de señalización del receptor de interactuar competitivamente en cerebelosa progenitores sugieren que el Notch1 CIE y activado Smad1/Smad4 fracciones convergen en un objetivo común. Se ha informado de que el Notch1 CIE se une al núcleo activador transcripcional P300 [47], y forma un complejo con p300/CBP-associated proteína (P / CAF), las prácticas comerciales restrictivas-J y como Mastermind-1 (MAML1) para activar la transcripción [48]. Recientemente, se ha demostrado que fosforilados Smad1 puede ser co-immunoprecipitated Notch con la CIE-1 en presencia de P300 y P / CAF [49], lo que sugiere que estas centrales transcripción co-activadores de Mayo mediar las interacciones entre Notch y BMP de señalización . Un intrigante complemento a lo anterior se sugiere en un reciente informe que contiene Smad1 fosforilación inhibitoria sitios que están dirigidos por la mitogen-activated proteína quinasa (MAPK) en cascada de señalización [50, 51]. Factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) de señalización del istmo podría, por tanto, potenciar la señalización Notch en el cerebelo primordio de la disminución de la capacidad de respuesta de los progenitores cerebelar rostral a BMPs secretada por el tejado placa.

El cerebelosa rhombic labio es una única zona germinal que produce hindbrain núcleos específicos, DCN, y gránulo de células precursoras de una manera regulada temporalmente. Nuestros resultados proporcionan una explicación mecanicista de la forma en que el curso de inducción de Math1 en cerebelosa progenitores esté regulada en el labio rhombic toda la embriogénesis. Debido a que el inicio de la neurogénesis en el labio rhombic comienza inmediatamente después de cierre del tubo neural, y continúa con retraso en el desarrollo embrionario, nos encontramos con un papel crítico para Notch1 señalización en el primordio cerebelosa durante este período para inhibir cerebelosa progenitores de responder prematuramente a rhombic labio señales inductivas . Le sugerimos esto representa el primero de una serie de funciones distintas que Notch1 realiza en el cerebelo de embriones. Proponemos Notch1 señalización actos iterativamente en el cerebelo progenitoras población, en primer lugar mediante la inhibición de la sobreproducción de comienzos de rhombic labio derivados neuronas, y luego por la regulación de la neurogénesis en la zona ventricular [19], y, por último, al estimular la gliogenesis [20, 33]. Por otra parte, además de Notch1, otros miembros de la familia Notch Se ha demostrado que regular gránulo de células precursoras de desarrollo durante la embriogénesis posible a través de interacciones recíprocas con Math1 [36]. Postnatalmente, Notch2 señalización se ha demostrado que regular la maduración de gránulo de células precursoras en la EGL de mantener en un estado proliferativo [35]. Así pues, parece que la vía de señalización Notch actúa para detener el estado de diferenciación cerebelosa precursores en múltiples etapas de desarrollo. Deciphering la forma en que la vía de señalización Notch modula la capacidad de respuesta de los progenitores neurales claves para el desarrollo será crucial para la comprensión de la regulación del crecimiento y la diferenciación del sistema nervioso central en toda la embriogénesis.

Métodos
Mouse genotipo y preparación de tejidos

Engrailed1-cre, floxed Notch1, Math1-lacZ, y Rosa26 stopLacZ ratones fueron genotipo tal como está descrita anteriormente [25 - 27, 29]. Para generar En1cre; floxNotch1 embriones, la cre-En1 línea se cruzó con animales homocigotos floxNotch1, y la consiguiente creación de En1; floxNotch1 / + hombres cruzaron con homocigotos floxNotch1 mujeres. En1cre; floxNotch1; Math1-lacZ animales fueron generados por el cruce En1cre; floxNotch1 (c / +) con Math1-lacZ; floxNotch1 (c +). La mañana del observó enchufe se consideró 0,5 días. Los embriones recogidos en E10.5 a E14.5 fueron fijadas en el hielo frío 4% de paraformaldehído /-buffer fosfato salino (PBS) durante 1 a 2 horas, se lavan en PBS, y equilibrada en 30% de sacarosa / PBS noche a la mañana. Embriones de más edad y adultos fueron perfundidos transcardially y el cerebro disecado antes de sacarosa equilibrio. Por cryosectioning, los embriones fueron montadas en los tejidos-Tek PTU (VWR, West Chester, PA) y seccionadas en 14 a 20 μ M.

Hibridación in situ e inmunohistoquímica

Sección de ARN antisentido hibridación in situ se realizó tal como está descrita anteriormente [52], con las siguientes sondas: Notch1, Math1, Mash1, Msx2, y Cath1. La inmunohistoquímica con anticuerpos contra el Math1 (antisuero de conejo; especie de regalo de J Johnson (UT Southwestern Medical Center), calbindin (antisuero de conejo; Swant, Bellinzona, Suiza), la placenta humana fosfatasa alcalina (ovejas α-PLAP antisuero; productos de investigación de América, Belmont , MA, EE.UU.), Zic2 (antisuero de conejo; especie de regalo de J Aruga (RIKEN Brain Science Institute), BLBP (antisuero de conejo, especie de regalo de T Anthony y N Heintz (Universidad Rockefeller), fosforilados Smad1 (IgG purificada de conejo; Señalización Celular Tecnologías, Danvers, MA, EE.UU.), y MSX1 / 2 (ratón anticuerpo monoclonal 4G1, ascitis, hibridoma Estudios del Desarrollo del Banco, Iowa City, IA, EE.UU.) se realizó tal como está descrita anteriormente [33].

Retrovirales inyecciones

Preparación, inyección y análisis histoquímico de control (CLE) y la CIE Notch1 (CLEN) retrovirus se han descrito anteriormente [33]. De larga duración para cDNA humanos Delta1 se subcloned en pCLE abajo del promotor EF1 α (CLED) y virus preparado como se indica más arriba. Se analizaron seis a ocho P21 cerebros para cada uno de los CLED y CLEN experimentos y encontró tres a cuatro por cada sustancial que ha infecciones en el cerebelo.

Chick electroporación

En ovo electroporación se realizó como se describió anteriormente [40], con las siguientes modificaciones. En concreto, cDNA para el Notch1 CIE fue subcloned en el vector de expresión de pollo pMiwIII, de tal manera que su expresión fue dirigida por el pollo β-actina promotor. El constitutivamente activa los receptores BMP 1b y las buenas prácticas agrarias construcciones se han descrito anteriormente [40]. Plásmidos se inyecta en el ventrículo a mediados de los hindbrain frontera (GFP, 0,2 μ g / μ l; Notch1 ICD, 1 μ g / μ l, y caBMPR, 0,33 μ g / μ l) y dos electrodos colocados a ambos lados del tubo neural. Cinco rectangular pulsos eléctricos de 15 voltios (50 ms cada uno) fueron entregados. Los embriones se recuperaron después de aproximadamente dos días más de incubación, fijo durante 1 hora en hielo frío 4% de paraformaldehído / PBS, lavado en PBS, y que se les permita equilibrar la noche a la mañana en el 30% de sacarosa / PBS antes de su montaje y cryosectioning. Al menos tres electroporated embriones fueron analizados para cada experimento.

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

Autores de las contribuciones

RPM realizó todos los experimentos con la asistencia de DJK mientras ella era un estudiante graduado en el laboratorio de GJF. El manuscrito fue escrito por RPM y GJF.

Material complementario
Archivo Adicional 1
El E10.5 istmo y el techo de placas no son abiertamente afectados por la pérdida de Notch1. Expresión análisis de fgf8, wnt1, y otx2 de hibridación in situ en las secciones de E10.5 control y En1cre; floxNotch1 embriones
2 ficheros adicionales
La muerte celular en el primordio cerebelosa no es abiertamente un aumento en E12.5 a la pérdida de Notch1. TUNEL manchas en las secciones de E12.5 control y En1cre; floxNotch1 embriones
3 ficheros adicionales
Notch induce la activación hes1 e inhibe la expresión cath1 en el primordio de pollo cerebelosa. Electroporación de Notch1 CIE en el cerebelo de pollo Anlage se traduce en un aumento en hes1 expresión y una disminución en cath1 medida por la sección hibridación in situ
Agradecimientos

Nos gustaría dar las gracias a Nick Gaiano para este estudio pionero, Staci Rakowiecki y Yuan Yuan Huang para la asistencia técnica, para James Li con una valiosa asistencia en electroporations ovo, y los miembros de la Fishell laboratorio y Alex Schier para lectura crítica del manuscrito. Damos las gracias J Johnson para el Math1 de anticuerpos, y el Math1 y Cath1 sondas, Rossant J de la sonda Notch1, Guillemot F Mash1 de la sonda, S Artavanis-Tsakonas para toda la longitud Delta1 cDNA, J L Timmer y Niswander de las buenas prácticas agrarias y caBMPR1b pollo construye la electroporación, T Anthony y N Heintz para la lucha contra la BLBP de anticuerpos, y J Aruga para la lucha contra la Zic2 de anticuerpos. Esta labor fue apoyada por una beca postdoctoral NIH (1F32NS42525-03) a RPM, y una subvención del NIH (R01 NS032993) a GJF.