Journal of Brachial Plexus and Peripheral Nerve Injury, 2007; 2: 5-5 (más artículos en esta revista)

Neurturin aumenta la recuperación de la función eréctil tras bilateral del nervio cavernoso aplastar lesión en la rata

BioMed Central
Anthony J Bella (abella@urology.ucsf.edu) [1], Thomas M Fandel (tfandel@gmx.de) [1], Kavirach Tantiwongse (kavirach@gmail.com) [1], William O Brant (willbrant @ gmail . com) [1], Robert Klein D (robertklein@gmail.com) [2], Carlos A García (carlos.a.garcia @ rinat.pfizer.com) [2], Tom Lue F (tlue@urology.ucsf . edu) [1]
[1] Knuppe Molecular Laboratorio de Urología y Servicio de Urología de la Universidad de California, San Francisco, EE.UU.
[2] Rinat Neuroscience, South San Francisco, EE.UU.

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Resumen
Fondo

Los mecanismos moleculares responsables de la supervivencia y la preservación de la función para adultos parasimpático neuronas ganglionares siguientes lesiones siguen siendo incompleta entendido. Sin embargo, los avances en la neurobiología de los factores de crecimiento, desarrollo neuronal, y la prevención de la muerte celular han dado lugar a una oleada de interés clínico de protección y regeneración neuromodulatory estrategias, como las terapias quirúrgicas de próstata, la vejiga y el cáncer colorrectal a menudo como resultado neuronal y axotomy debilitante pérdida de la función sexual o la continencia. Los estudios in vitro han identificado neurturin, una línea de células gliales derivadas de factor neurotrófico, como neuromodulator pélvico para las neuronas colinérgicas. Se presenta el primer informe en vivo de los efectos de neurturin a la recuperación de la función eréctil tras bilateral del nervio cavernoso aplastar lesión en la rata.

Métodos

En estos experimentos, los grupos (n = 8 cada una) consistió ileso de los controles y los animales tratados con la inyección de albúmina (cegados aplastar grupo control), cursó liberación neurotrophin-4 o neurturin al sitio de nervio cavernoso aplastar lesiones (100 μ g por animal) . Después de 5 semanas, la recuperación de la función eréctil (el efecto del tratamiento) fue evaluada por la electroestimulación del nervio cavernoso y pico de presión aórtica se midieron. Los investigadores fueron cegados a tratamientos específicos después de los análisis estadísticos se realizaron.

Resultados

La disfunción eréctil no se observó en el grupo de tratamiento simulado (media máxima presión intracavernosa [PCI] aumento de 117,5 ± 7,3 cmH 2 O), mientras que las lesiones nerviosas y la albúmina tratamiento (control) produjo una reducción significativa en el PCI elevación de 40,0 ± 6,3 cmH 2 O . Neurturin facilitó la preservación de la función eréctil, con una PCI aumento del 55% a 62,0 ± 9,2 cmH 2 O (p <0,05 vs control). Extensión liberación neurotrophin-4 no aumentar considerablemente la recuperación de la función eréctil con un PCI cambio de 46,9 ± 9,6. Peak aórtica la presión arterial no difirieron entre los grupos. No existió pre y post-tratamiento de peso se observaron diferencias entre el control, neurotrophin-4 y neurturin cohortes. Todos los animales toleran las cinco semanas de tratamiento.

Conclusión

El tratamiento con neurturin en el lugar del nervio cavernoso aplastar lesión facilita la recuperación de la función eréctil. Resultados de una investigación más a fondo el apoyo de neurturin como un neuroprotector y / o agente neuroregenerative facilitar la recuperación funcional después de cavernoso pélvico u otras lesiones de los nervios autonómicos.

Fondo

La incontinencia urinaria y la disfunción eréctil sigue siendo una causa común de debilitante post-operatorio morbilidad para una proporción significativa de pacientes sometidos a terapias radical de próstata, la vejiga y el cáncer colorrectal, como la pelvis autonómica neuronas son inadvertidamente axotomized, lacerado, o estirado en el momento de la cirugía [ 1]. Por ejemplo, series contemporáneas informe que la probabilidad de que la disfunción eréctil tras prostatectomía radical para el cáncer clínicamente localizado de la próstata es 30-80% en 24 meses. A pesar de los avances en la técnica quirúrgica, la mayoría de los hombres demostrar comprometida la función eréctil (incompleto, retraso, o la falta de post-quirúrgica potencia) como distintos grados de daño en los nervios cavernoso ocurrir incluso bilaterales con los nervios ahorradores de los procedimientos [2].

El nuevo concepto de terapia neuromodulatory reconoce que, aunque el sistema nervioso periférico demuestra una intrínseca capacidad de regenerarse después de la lesión, esta innata respuesta es un tanto limitada y no suele permitir una plena recuperación de la función [3]. La acumulación de pruebas sugiere que el retorno a la potencia siguiente perjuicio para el cavernoso nervios depende parcialmente de la regeneración axonal en el resto de los tejidos neuronales y varias estrategias de tratamiento que ofrece el potencial para facilitar la recuperación son actualmente objeto de investigación en modelos animales, incluidos los neurotrophins, immunophilin ligandos, la fosfodiesterasa -5 Inhibidores, y las células madre embrionarias [1, 4 - 6]. Colateral brotación de los axones se produce después de lesión aguda para los adultos las neuronas periféricas y el crecimiento conos objetivo entornos locales de apoyo de la regeneración. Mecanismos moleculares de este proceso siguen siendo incompleta para entender parasimpático neuronas, como de investigación a menudo se ve obstaculizada por dificultades selectiva hiriendo a estas neuronas, que a menudo se encuentran muy cerca o dentro de sus órganos diana [3]. Línea de células gliales derivadas de neurotrófico factores, entre ellos la línea de células gliales derivadas de factor neurotrófico (GDNF), neurturin (NTN), persephin, artemin y representan una clase de nuevos agentes neuroprotectores y con neuroregenerative propiedades [7]. La retrógrada mecanismo de transporte axonal de las neuronas motoras ya ha sido explotada para entregar el gen que codifica GDNF en el sistema nervioso central, proporcionando apoyo trófico siguientes lesiones [8]. NTN GDNF y también se han mostrado a promover la supervivencia y el mantenimiento del parasimpático craneal neuronas a través de un Ret receptor tirosina-quinasa de señalización y un componente glycosylphosphatidylinositol-anclado GDNF familia del receptor α (α GFR) del receptor de proteína compleja [9]. Los estudios in vitro han de neurturin demostrado estimulación de neurite parasimpático sacro extensión de los ganglios cultivos de tejidos a través de la Pi3-quinasa y sugerir vía NTN actúa como un objetivo derivado de la supervivencia y / o neuritogenic factor de erección del pene para inducir el postganglionic neuronas a través de un mecanismo de señalización neurotrófica distinta de otras neuronas parasimpático [ 10 - 12]. Hasta la fecha, mejoras funcionales secundarias a neurturin tratamiento no han sido probadas. En este estudio, los in vivo neuromodulatory efectos de neurturin a la recuperación de la función eréctil tras bilateral del nervio cavernoso aplastar lesión se demostró mediante un modelo de rata de impotencia neurogénica.

Métodos
Purificación de neurturin

Recombinante rata neurturin (NTN) se expresó en E. coli como un órgano de inclusión. Lisis celular se realizó en un micro-fluidizer, repetido, y cuerpos de inclusión fueron solubilized en 6 M guanidina-HCl, 0,1 M sulfito de sodio, 0,01 M terathionate y sodio 0,02 M Tris pH 8,0 durante 4 horas a 25 ° C. La separación de solubilized inclusión cuerpo rata NTN se logró mediante centrifugación a 7000 rpm durante 1 hora, que fue dializados en guanidina 4 M-HCL, 1 mM imidazol, y fosfato 0,01 M (pH 7.2). NTN desplegadas rata fue purificado por una afinidad Nickle cargo de resina Ni-NTA SuperFlow la columna (Qiagen Inc, Valencia, California, EE.UU.). Solubilized rata NTN se lava con 10 × (diez veces) el volumen de la columna 10 mM imidazol, y eluye con 0,4 M imidazol. Rat NTN fracciones se intercambiaron en pre-refolding una solución tampón que contiene 4 M urea, fosfato 0,1 M, 10% glicerol, 0,02 M glicina, y 0,02 M Tris pH 8,2. Refolding La reacción se llevó a cabo mediante la dilución de rata NTN 10 × 3 M urea, el 15% de glicerol, fosfato 0,075 M, NaCl 0,3 M, 0,02 M glicina, la cisteína 2 mM, y 0,02 M Tris pH 8,2, que se dejó incubando a 4 ° C durante 48 horas. Di-filtración se realizó en ratas y refolded NTN se formuló en 0,2 M de acetato de sodio pH 3,8. NTN Refolded rata fue nuevamente purificada por Toyopearl 650 M-fenil sepharose HIC medios de comunicación (Tosoh Corp, Tokio, Japón). Rat NTN fue cargado en 0,2 M de acetato de sodio y 0,750 M NaCl. Una columna de 10 × volumen de lavado se realizó en 1 M de NaCl, seguida de elución de rata NTN HIC en los medios de comunicación con 0,2 M de acetato de sodio. Decapado de rata, desplegadas NTN y la contaminación se logró mediante la adición de 25% ETOH a los medios de comunicación de HIC. Por último, refolded rata NTN se formuló en 10 mM de acetato de sodio pH 3,8.

Estudios funcionales

Treinta y dos machos Sprague-Dawley, las ratas (3 meses de edad, 250-350 g) fueron divididos aleatoriamente en cuatro grupos, cada uno con ocho animales. Los controles recibieron un simulacro de operación sólo (identificación de los nervios cavernosa bilateral). Los restantes 24 animales fueron divididos en 3 grupos de tratamiento (grupos A, B y C). Los animales en los grupos de tratamiento se sometió a un tratado bilateral del nervio cavernoso aplastar las lesiones, seguido por la inyección directa de cualquiera de albúmina (cegados grupo control), cursó liberación NT-4 o neurturin (dosis de 100 ug por animal; microesferas suspendidas en solución tampón fosfato) para la sitio de lesión. Todos los experimentos con animales fueron aprobadas por el comité de ética local para la experimentación (Universidad de California, San Francisco, Institucional y de Uso Animal Care Committee) y cumplido con los Institutos Nacionales de Salud (NIH) los reglamentos para el cuidado y el uso de animales de laboratorio.

Los animales fueron anestesiados para procedimientos quirúrgicos utilizando intraperitoneal ketamina (100 mg / kg) y xylazina (10 mg / kg) y mantiene isotérmico en un acalorado almohadilla. Después de que el animal se le rasuró, una línea media inferior incisión abdominal puso de manifiesto la glándula prostática y el cavernoso los nervios y los principales ganglios pélvicos (MPG) se identificaron a nivel bilateral. No adicionales pélvico manipulación quirúrgica se realizó en el grupo control. En los grupos A, B y C, el cavernoso nervios fueron cuidadosamente aislados y aplastar la lesión inducida utilizando una aguja quirúrgica conductor en un constante 'de un solo clic "presión durante 2 minutos por lado. La pared abdominal se cerró en dos capas.

A las 5 semanas, la función eréctil se evaluó midiendo la máxima presión intracavernosa (ICP) directo a la electroestimulación del nervio cavernoso. El cavernoso nervios fueron aislados a través de una línea media repetir incisión abdominal y la crura del pene se identificó. A 23 de calibre aguja mariposa con 250 U / ml de solución de heparina se inserta en el pene y formatos especiales de polietileno conectado a-50 tubos de medición para el PCI. Un bipolar gancho de acero inoxidable de electrodos (2 mm de diámetro sondas separadas por 1 mm) estimuló el nervio cavernoso. Monofásica rectangular pulsos fueron generadas por un ordenador con una costumbre construido amplificador de corriente constante. El estímulo parámetros fueron 1,5 mA, 20 Hz, ancho de pulso 0,2 ms, y la duración 50 s. Cada nervio cavernoso se vio estimulada por separado, medidos por medio de ICP 4,0 software LabVIEW (National Instruments, Austin, Texas), y la media máxima de derecha e izquierda PCI determinará para cada rata. La presión arterial sistémica se midió antes de que se da por concluido el procedimiento utilizando una mariposa aguja insertada en la aorta.

Los datos fueron analizados por la no-ANOVA de medidas repetidas con importancia considerados en p <0,05. Si la diferencia fue significativa, Estudiantes Newman-Keuls test se realizó. Todos los resultados se expresaron como media ± SEM. Animal pesos antes y después del tratamiento fueron comparados. Si un acontecimiento adverso ocurrido, la causa de la mortalidad temprana o la suspensión del tratamiento (por ejemplo, pérdida de peso, lesiones visibles / tumor) y timepoint se señaló. Los investigadores fueron cegados después de los análisis estadísticos se realizaron.

Resultados

Para evaluar la recuperación de la función eréctil, el aumento de la presión intracavernosa máxima (que corresponden a la rigidez del pene en los hombres) se midió (Figura 1]. La disfunción eréctil no se observó en el grupo control ileso, que sirvió para establecer una línea de base normal eréctil respuesta a la estimulación. La máxima presión intracavernosa [PCI] aumento observado fue 117,5 ± 7,3 cmH2O. El grupo de control ciego, que fue tratado con albúmina solamente, demostraron una reducción significativa de aumento de PCI de 40,0 ± 6,3 cmH2O, en consonancia con un estado de disfunción eréctil. Neurturin facilitó la preservación de la función eréctil, con una media PCI aumento del 55%. El aumento de 62,0 ± 9,2 cmH2O fue estadísticamente significativa (p <0,05 vs control). Extensión liberación neurotrophin-4 no aumentar considerablemente la recuperación de la función eréctil con el PCI cambios de 46,9 ± 9,6 (Tabla 1]. No hay diferencias estadísticamente significativas se observaron entre todos los grupos de pico aórtica la presión arterial o aumento de peso. No se encontraron animales muertos o incompletos tratamientos en este estudio.

Discusión

Una clara necesidad clínica para el desarrollo de intervenciones terapéuticas neuromodulatory se ha definido como simpático y parasimpático pélvico inervación está en alto riesgo de lesiones durante la cirugía o terapia de radiación para próstata, vejiga, colon y tumores malignos. Erección del pene, controlada por adrenérgicos, colinérgicos, y nonadrenergic noncholinergic (NANC) neuroeffectors transportarse en el cavernoso los nervios, es a menudo comprometida por estos tratamientos, los pacientes y la posterior calidad de vida disminuida [4]. A pesar de los avances en la técnica quirúrgica, la probabilidad de que un hombre abierto en la prostatectomía retropúbica radical para la enfermedad clínicamente localizada y lograr el control de cáncer, la continencia y la potencia es de aproximadamente 60% a los 24 meses [12]. Neurturin, que se expresa en objetivos neuronal periférico incluido el pene, ha demostrado clave neuromodulatory propiedades incluyendo el transporte retrógrado de la periferia al cuerpo celular, el mejoramiento de la supervivencia neuronal y la promoción de neurite resultado [13 - 15]. En este estudio, neurturin demostrar la capacidad de conferir una ventaja en vivo para la recuperación funcional de la función eréctil tras lesión del nervio cavernoso.

Varios métodos de inducir daño a los nervios cavernoso se describen en la literatura e incluyen los nervios transection, Crioablación, y aplastar la escisión parcial [16]. Nosotros preferimos utilizar un controlada bilateral del nervio aplastar la técnica, tan importante, pero reversible el daño a la inervación del pene y permite que se produce para la evaluación de recuperación funcional. Las ventajas de esta técnica son la sencillez, fiabilidad, reproducibilidad y, aunque la relación con el trauma quirúrgico que haya incurrido la prostatectomía es inexacta como la próstata en sí no se elimina [17]. Debido a NOS que contienen los nervios y neuronas son los principales sitios en los que la erección de inducir neurotransmisor óxido nítrico (NO) es sintetizado, su pérdida después de lesión del nervio, por lo tanto, es principalmente responsable para el desarrollo de la ED. El uso de este modelo animal de ED neurogénica, hemos demostrado anteriormente una pérdida significativa de la síntesis de óxido nítrico (NOS) que contienen las fibras nerviosas y las neuronas en los cuerpos cavernosos y en los principales ganglios pélvicos (MPG), respectivamente, dentro del mes siguiente bilateral del nervio cavernoso aplastar las lesiones [18].

Neurturin aplicarse directamente a la zona de la lesión facilitó la preservación de la función eréctil en comparación con los animales control no tratado y ampliado liberación neurotrophin-4. La principal medida de resultado, con una media de aumento de la presión intracavernosa, se ha utilizado ampliamente como medida de la rigidez peneana (función) en una amplia variedad de grupos de riesgo y modelos animales, y es un factor unificador para definir la respuesta en el tratamiento de la disfunción eréctil en el hombre [19 ]. En un estudio reciente informó de investigar la relación entre la presión arterial media y el PCI, MacKenzie et al demostraron que los cambios en los valores del PCI se han visto adversamente a cabo sólo cuando la presión arterial media (PAM) se situó por debajo de 70 mmHg (independientemente de la causa) [20]. Aorta presiones tras la determinación del PCI no difirió entre los grupos y cada uno de los animales demostraron valores de 100 mmHg o superior. Por lo tanto, un catéter en la arteria carótida no fue colocado para controlar la presión arterial simultáneamente con la estimulación del nervio cavernoso como realizadas en el pasado, reducir al mínimo la morbilidad indebida y el estrés fisiológico en la rata a lo recomendado por nuestra Junta de Revisión Institucional. Además, nuestra preferencia es observar la forma de onda y el PCI en lugar de cambiar la relación del PCI / BP; pacientes hipertensos pueden tener anormal PCI / MAP ratios pero suficiente rigidez del pene (con la presión intracavernosa superior a 100 mmHg) y no serían etiquetados como impotente.

A raíz de las lesiones, compensatorias y de regeneración de brotes de pene-la proyección de las fibras nerviosas es probable impulsada por, y depende de diversos factores, entre ellos neurotrófico NTN, que se sintetiza en los tejidos urogenitales incluyendo el pene y también puede ser secretada por las células gliales en el ganglio o neuroglia asociados con el axón lesionado (s) [3]. Conocidos los receptores para incluir neurturin la familia GDNF los receptores α1, α2 (predominante), y α4, y se han identificado en los principales pélvico ganglionares [21]. Parasimpático pélvico neuronas ganglionares de responder a axotomy de alterar la expresión de receptores de NTN; alterado gliales secreciones o gliales acoplamiento complementarios representan un segundo mecanismo de señalización en adapative primeras fases de la regeneración [3]. Como proyección de pene-pélvica neuronas expresar neuronal de óxido nítrico (nNOS) y GFR α2, acumulando el cultivo de tejidos, células de la línea, señalización en vivo, y con este informe, las pruebas funcionales, neurturin sugiere que juega un papel importante en la regeneración, así como el mantenimiento de adultos parasimpático neuronas [11, 22]. Dadas las limitaciones de este estudio piloto, incluyendo la dosificación óptima desconocido o sitio de entrega NTN (aplastar sitio frente a las principales ganglio pélvico o pene), y una comprensión incompleta de la neurobiología del nervio cavernoso y neurturin interacción, los resultados son alentadores y justifican un estudio más detenido de NTN en esta función. Después de un curso similar a nuestro cerebro de las investigaciones derivadas de factor de crecimiento nervioso y su papel en el nervio cavernoso respuesta a la injuria, tenemos previsto centrarse en la identificación de las principales vía de señalización molecular (s), dependiente de la concentración efectos, y el patrón (s) de neurturin liberación endógena en un mejor efecto para delimitar su neuroregenerative o propiedades neuroprotectoras [23, 24].

Un número cada vez mayor de la literatura sugiere neurturin puede representar un agente terapéutico prometedor para ambos central y periférico enfermedades neurológicas estados, la mejora de la supervivencia, diferenciación y regeneración de las neuronas por sí solas o sinérgicamente con otras moléculas. Además de las lesiones traumáticas, impotencia neurogénica se asocia a menudo con enfermedades relacionadas con deficiencias sensoriales y / o neuropatía periférica, como la diabetes mellitus [1]. Como los tejidos del pene se sabe expresar mRNA transcripciones durante al menos 10 neurotrófico factores, estrategias de tratamiento utilizando neurturin y Neuromoduladores estas solo o en combinación pueden representar el futuro enfoques para aliviar ED causada por lesiones, neurológicos o de los cambios vasculares [25, 26]. Desde una perspectiva más amplia, elucidar los mecanismos por los que neurturin nervio periférico aumenta la reparación y recuperación funcional puede traducirse en aplicaciones clínicas para condiciones tan diversas como nervio laríngeo recurrente y las lesiones del plexo braquial, iatrogénica neuropraxias, o la incontinencia urinaria secundaria a la histerectomía.

Conclusión

El tratamiento con neurturin en el lugar del nervio cavernoso aplastar lesión facilita la recuperación de la función eréctil en un marco bilateral del nervio cavernoso aplastar lesión modelo de la disfunción eréctil en la rata. Resultados de una investigación más a fondo el apoyo de neurturin como un neuroprotector y / o agente neuroregenerative siguientes cavernoso pélvico u otras lesiones de los nervios autonómicos.

Conflicto de intereses

AJB, TMF, KT, y Wob no declarar los intereses en competencia. RDK y CAG son empleados de Rinat Neuroscience en el momento de este estudio. TFL recibido fondos para este estudio de Rinat Neuroscience.

Autores de las contribuciones

AJB diseñó el estudio, realizado aplastar el perjuicio (IC) cirugías, la medición de la respuesta de la presión intracavernosa de la electroestimulación (ICP), y redactó el manuscrito. TF y KT ayudado a realizar CI y PCI cirugías. Wob participó en el diseño del estudio, la redacción del manuscrito, y se lleva a cabo análisis estadísticos. RDK y CAG sintetizado neurturin, cursó a la liberación neurotrophin-4 y el control ciego, y han contribuido NTN la purificación de protocolo del manuscrito. TFL concibe el estudio, participaron en su diseño y redacción del manuscrito.

Agradecimientos

Este estudio fue apoyado por una subvención sin restricciones de Rinat Neuroscience.

Dr AJ Bella es la American Urologic Association Fundación Robert J. Krane Académico y del Real Colegio de Médicos y Cirujanos (Canadá) Detweiler Viajar por becario.