Acta Histochemica et Cytochemica, 2007; 40(1): 27-34 (más artículos en esta revista)

Localización de los receptores estrogénicos α y β en la superficie articular de la rata Fémur

Sociedad Japonesa de Histoquímica y Citoquímica
Yasushi Oshima [1], Ken-ichi Matsuda [2], Atsuhiko Yoshida [1], Nobuyoshi Watanabe [1], Mitsuhiro Kawata [2], Toshikazu Kubo [1]
[1] Departamento de Ortopedia, Escuela de Estudios Superiores de Ciencias Médicas, Kyoto Prefectural University of Medicine, Kyoto 602-8566, Japón
[2] Departamento de Anatomía y Neurobiología, Escuela Superior de Ciencias Médicas, Kyoto Prefectural University of Medicine, Kyoto 602-8566, Japón

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Resumen

Se ha sugerido que la degradación del cartílago articular y la osteoartritis (OA) que están relacionados con el género y la hormona estrógeno. Aunque muchos investigadores han reportado la presencia de los receptores estrogénicos (RE) α y β en la que el cartílago articular, la localización de estos receptores y la diferencia en su expresión in vivo aún no han sido claramente demostrada. Se realizó la tinción de inmunofluorescencia ER ER α y β para dilucidar la localización de la RE y observar los efectos de género y el proceso de envejecimiento en estos receptores. Los resultados revelaron que ER ER α y β se expresaron en las que el cartílago articular y hueso subchondral capas de ratas adultas de ambos sexos. También se observó la alta expresión de estos receptores en ratas inmaduras. Por el contrario, sus niveles de expresión se redujo en un ovariectomised modelo, como una simulación de postmenopause, y en edades comprendidas entre ratas hembras. Por lo tanto, este estudio sugiere que los efectos directos de los estrógenos y ER expresión en la superficie articular del metabolismo.

I. Introducción

Primaria de la osteoartritis (OA) es una enfermedad causada por la degradación del cartílago articular. Se produce en un mayor número de mujeres que hombres, y las tasas de prevalencia e incidencia aumento en las mujeres posmenopáusicas. Por lo general, los síntomas de la OA son más graves en mujeres que en hombres. Por lo tanto, se ha sugerido que tanto el género y la hormona estrógeno puede desempeñar un papel en la OA.

El estrógeno se ha conocido a actuar a través de los receptores estrogénicos (RE). Recientemente, se ha informado también de que hay dos subtipos de RE, ER ER α y β [7, 13]. Kuiper et al. Demostrado la distribución de ambos ER ER α y β genes en tejidos de rata mediante el uso de transcripción inversa-reacción en cadena de polimerasa (RT-PCR). La expresión de ER α fue de moderada a fuerte en el útero, testículos, hipófisis, ovarios, riñones, epidídimo, glándula suprarrenal y tejidos. ER β mostró un patrón de expresión similar a la próstata, ovarios, pulmón, vejiga, cerebro, útero, testículos y [8]. Brandenberger et al. Realizó RT-PCR utilizando tejidos fetales humanos y encontró que ER α producido más abundante en el útero, mientras que grandes cantidades de β ER se encuentran en los ovarios, testículos, tejido suprarrenal y el bazo [2].

Ushiyama et al. Demostrado la expresión de la ER α y β ER genes humanos en los condrocitos articulares mediante RT-PCR. Se informó de que la expresión de los RE fue mayor en hombres que en mujeres. Sin embargo, no hubo diferencia entre los conjuntos de sitios o entre lo normal y cartílago osteoartríticos en este sentido [24]. A pesar de que puso de manifiesto que tanto el RE se expresan en la que el cartílago articular, la localización de estos receptores no estaba claramente demostrada. Para evaluar la localización de la RE, Yamada et al. Demostrado mediante la tinción inmunohistoquímica de ER α en la que el cartílago articular de la articulación temporo-mandibular en el modelo de rata [27]. ER-α positivo condrocitos se encontraron más abundante en las maduras y las capas de células hipertróficas del cóndilo que en el fibroso y proliferativa capas. El uso de inmunohistoquímica, Nilsson et al. Demostrado la tinción de ER β humanos en la placa de crecimiento del cartílago [14]. Condrocitos en la capa hipertrófica están bien manchadas, pero no se observó manchas en la condrocitos en el descanso y proliferativa capas.

No se ha determinado si ER ER α y β se expresan en todas las capas de la carga común que el cartílago articular. Además, la diferencia en la expresión de ER ER α y β y si ER expresión se ve afectada por el proceso de envejecimiento en vivo siguen sin estar claros.

En este estudio, se realizó la tinción de inmunofluorescencia ER ER α y β en la rata cartílago femoral, prestando especial atención a la ubicación de la RE, sino que también trataron de identificar las diferencias que surjan debido a los efectos de sexo, edad, u ovariotomía.

II. Materiales y Métodos
Animales

Hombre de 3 meses de edad (n = 3), y las mujeres de 1 día (n = 3), 1 semana (n = 3), 1 mes (n = 3), 3 meses (n = 6), y 24 meses de edad (n = 3) ratas Wistar fueron utilizados. Moorthy et al. Informó de que las ratas hembras jóvenes (3 meses de edad) muestran 4 o 5 días los ciclos estro, pero que durante el proceso de envejecimiento ciclos irregulares se producen en algunas de las ratas hembras a la edad de 12 meses [12]. Lu et al. Informó de que la incidencia de irregular ciclo de envejecimiento en ratas aumentó a un 65% más de 12 meses de edad [10]. En este estudio de 24 meses de edad, se utilizaron ratas como el envejecimiento de ratas.

Todos los procedimientos experimentales fueron aprobadas por el Comité de Investigación Animal, Kyoto Prefectural University of Medicine, Japón.

Ovariotomía tratamiento

Femenino 3 meses de edad ratas (n = 3) fueron anestesiados por inyección intraperitoneal de pentobarbital de sodio (35 mg / kg de peso corporal), y se ovariectomized bilateral (OVX), bajo la técnica quirúrgica estéril. Las ratas fueron autorizados a circular libremente después de la operación a una temperatura de ambiente controlado con un niño de 12 hr luz-oscuridad ciclo, y luego sacrificado 1 mes después de OVX tal como está descrita anteriormente [10]. En este experimento hemos utilizado ratas OVX como un modelo en el que la producción de estrógenos ha disminuido. La media de la concentración plasmática de estradiol en ratas OVX-y 3 meses de edad ratas hembras fue de 10 pg / ml y 40 pg / ml (30-50 pg / ml) (datos preliminares), respectivamente.

Evaluación histológica

Las ratas fueron anestesiados con pentobarbital sódico, perfundidos con solución salina fisiológica, luego fija con 4% paraformaldehído (PFA) en 0,1 M tampón fosfato (PB). Distal partes del femora fueron post-fijadas en una solución de fijación (4% PFA en 0,1 M PB) durante 24 horas a 4 ° C, entonces descalcificadas con EDTA 0,5 M (pH 7,5, Wako, Osaka, Japón) durante 2 semanas a temperatura ambiente (RT). Después de 2 semanas de descalcificación, gradiente de reemplazo con 20% de sacarosa de 24 horas a 4 ° C se realizó. El femora fueron ultracongelados y cortado en 14 μ m de espesor secciones en un criostato (CM3050 S, Leica, Nussloch, Alemania) tal como está descrita anteriormente [17, 18]. Por último, las secciones fueron teñidas con 0,05% de azul de toluidina para examen histológico.

La tinción de inmunofluorescencia

En las secciones siguientes, inmediatamente después de los cuales fueron teñidos con azul de toluidina, fueron utilizados para la tinción de inmunofluorescencia. Las diapositivas se enjuagado 3 veces con tampón fosfato salino 0,09% en NaCl 0,02 M PB durante 5 min, luego tratados con 0,3% Triton X-100, el 1% de albúmina de suero bovino (BSA) en PBS durante 30 min a TA. Las diapositivas se incubaron durante 60 horas con un conejo policlonal anti-ER α IgG (MC-20, Santa Cruz de Biotecnología Inc, CA, EE.UU.) [22], o ER β IgG (Z8P, Zymed Laboratories Inc, CA, EE.UU.) [ 3, 6, 16], a una dilución de 1:200 en 0,3% Tritón X-100, 1% BSA en PBS a 4 ° C. Las diapositivas se enjuagado 3 veces con PBS durante 5 min, luego incubadas con 488 etiquetada Alexa anti-anticuerpo IgG de conejo en una dilución de 1:1000 en 0,1% Tritón X-100, 2% BSA en PBS, durante 2 horas a 4 ° C. Después de un enjuague (3 veces) con PBS durante 5 min a TA, las secciones fueron incorporados en Gelvatol (13% alcohol polivinílico, el 33% de glicerol en 0,2 M Tris HCl) y fueron evaluados por láser confocal de barrido microscopio (LSM 510 META, ZEISS , Jena, Alemania).

III. Resultados

Ambos ER ER α y β son anticuerpos disponibles comercialmente, y la especificidad se ha demostrado en muchos tejidos [3, 6, 16, 22]. Un control positivo el estudio mostró inmunoreactividad para ER ER α y β en PFA fijo pituitaria tejido se encuentra en la región de las células del lóbulo anterior, que era la misma reactividad como se informó anteriormente [15] (datos no presentados). Además, un control negativo estudio de tinción inmunohistoquímica se realizó utilizando el mismo procedimiento de coloración, esta vez sin el conejo anti-ratón RE. No hubo señales en estas secciones (datos no presentados).

De un día de edad

La forma del hueso femoral ya se había formado, pero la osificación endochondral no se completa en este intervalo de tiempo. Casi todas las áreas mostraron epífisis metachromatic tinción de azul de toluidina, lo que indica la existencia de la matriz cartilaginosa, y la celularidad de la epífisis zonas es muy elevada (Fig. 1 A). Casi todas las células tanto en el superficial y las capas profundas de las zonas epífisis se colorearon con ER ER α y β incluido su núcleo y citoplasma (Fig. 1 D, E flechas, puntas de flecha). Tanto el citoplasma y núcleos parecen estar teñidas en la mayoría de las células, sin embargo, sólo el citoplasma o el núcleo sólo se colorearon en algunas células de estos anticuerpos. No hubo notables diferencias entre el número de células teñidas de ER ER α y β, y ER α tiende a manchar más fuerte que ER β (Fig. 1 B, C, Tabla 1].

De una semana de edad

Casi todas las áreas que aún epífisis mostró metachromatic tinción de azul de toluidina en este intervalo de tiempo (Fig. 2 A). Casi todas las celdas en las superficiales y las profundas capas fueron teñidas con ER ER α y β incluido su núcleo y citoplasma (Fig. 2 D flecha, punta de flecha). No hubo cambio notable en comparación con la de un día de edad, modelos, y las células teñidas aún más fuerte por ER α por β ER (Fig. 2 B, C, Tabla 1].

De un mes de edad

Endochondral osificación se inició, y subchondral hueso había formado, sin embargo, el cartílago articular no está bien desarrollado en este intervalo de tiempo (Fig. 3 A). Casi todas las células tanto en el cartílago articular y hueso subchondral capas fueron teñidas con ER ER α y β. La fuerza de la señal ER α fue similar a la de ER β (Fig. 3 B, C, Tabla 1].

Tres meses de edad las mujeres y los hombres

El cartílago articular y hueso subchondral se madura y bien formados en este intervalo de tiempo (Figs. 4 A, 5 A). En las ratas hembras, casi todas las células de la capa superficial del cartílago articular se colorearon con ER ER α y β (Fig. 4 B, C). Sin embargo, algunas de las celdas en las capas más profundas del cartílago articular y hueso subchondral capas no fueron teñidas con RE (Fig. 4 B, C flechas). Del mismo modo, casi todas las células de ratas macho expresada ER ER α y β. Esto fue particularmente evidente en la capa superficial (Fig. 5 B, C, Tabla 1].

Veinticuatro meses de edad

No hubo degradative notable cambio en la superficie articular, sin embargo, el grosor del cartílago es la capa más delgada que la de las modelos más jóvenes (Fig. 6 A). Algunas de las células en la capa superficial del cartílago articular se colorearon con ER ER α y β incluidos núcleo y el citoplasma (Fig. 6 D, E flechas, puntas de flecha), pero el número de ER α células teñidas ha disminuido. Sólo unas pocas células en las capas más profundas del cartílago articular y hueso subchondral se colorearon con ER ER α y β (Fig. 6 B, C, Tabla 1].

Un mes después de OVX femenino

No hubo notables síntomas de inflamación o infección después de OVX tratamiento. En comparación con la superficie articular de 3 meses de edad del sexo femenino, no hubo notable degradación o cambio osteoartríticos 1 mes después de OVX en la tinción de azul de toluidina (Fig. 7 A). Si bien no hubo diferencia entre ER α y β ER, el número de células teñidas ha disminuido drásticamente, y los resultados fueron similares a los de edades comprendidas entre los modelos de rata (Fig. 7 B, C, Tabla 1].

IV. Discusión

Con el fin de evaluar la localización y los cambios de ER ER α y β expresiones en la superficie articular, debido a género, edad, u ovariotomía, tinción de inmunofluorescencia se realizó con un modelo de rata. Los resultados mostraron que tanto ER ER α y β fueron localizados y se expresa en el cartílago articular y hueso subchondral de los jóvenes y maduros ratas hembras maduras y las ratas macho. En ratas jóvenes, el grado de tinción ER α parecía ser más fuerte que la de ER β, sin embargo, el número de células teñidas fue similar entre ER α y β ER. Con el envejecimiento o de OVX, el grado de coloración de la ER α se convirtió más débiles. En comparación con las ratas hembras maduras, los ancianos y las ratas hembras OVX ratas mostraron una marcada disminución del número de ER α células teñidas. En el envejecimiento de ratas, el grado de tinción ER β es igual que en las ratas hembras maduras. La función de ER β puede ser diferente de la de ER α.

Monje y Boland informó de que ER ER α y β se localizaron no sólo al núcleo, sino también en el citoplasma de las células de conejo en el útero y ovario [11]. Levin demostrado que la transducción de señales se han producido a través de exigencias ambientales en el núcleo, membrana plasmática, citoplasma y entre ellos las mitocondrias [9]. En nuestro estudio, el ERS fueron localizados en ambos núcleo y citoplasma en el tejido del cartílago. En cuanto a la importancia de la localización intracelular de ER α y β ER, es posible que la señal a través de las vías de núcleo y citoplasma incluyendo las mitocondrias dependen de la hormona estrógeno. El estrógeno puede tener algunos efectos directos sobre los condrocitos a través de los receptores de estrógenos.

Debido a que la prevalencia y la incidencia de OA no sólo difiere entre los géneros, sino también entre premenopáusicas y las mujeres posmenopáusicas, se considera que la degradación del cartílago articular se asocia con la hormona estrógeno, y que la terapia de reemplazo de estrógeno (ERT) tiene un efecto sobre la el cartílago articular. RAVN et al. Utilizarse oral y estradiol transdérmico terapias y la degradación del cartílago evaluados y la resorción ósea mediante la medición del contenido de C-telopéptidos de tipo I y tipo II de colágeno en la orina mediante un inmunoensayo enzimático (ELISA) [19]. Utilizando imágenes de resonancia magnetica, Wluka et al. Calcula la diferencia en la cantidad de cartílago de rodilla en las mujeres mayores de 50 años que había o bien no había sufrido ERT [25]. En su estudio humano, que llegó a la conclusión de que en las mujeres posmenopáusicas, ERT siempre protegidos contra la artrosis y la osteoporosis. Sin embargo, más adelante en su largo estudio de seguimiento, Wluka et al. Informó de que más tarde ERT no tuvo ningún efecto sobre el cartílago [26]. Además, Tsai y Liu informó de que una inyección intraarticular de estradiol en realidad inducida por OA de la rodilla en su estudio de conejo. En su experimento, el cambio en la OA es claramente diferente entre los de alta y baja dosis de grupos, así como entre el corto y largo plazos [23]. Por otra parte, otros investigadores han informado también de que la TRE no tiene efecto significativo sobre el cartílago articular. Consideraron que resultados se obtuvieron debido a las diferencias entre humanos y especies animales, el tamaño de las muestras, in vivo e in vitro modelos, la dosis de estradiol, y la duración del tratamiento [23, 24]. Así pues, el efecto del estrógeno sobre el cartílago aún no se ha determinado [1, 4, 20].

Se ha reconocido que existe una relación entre los estrógenos y los huesos, y que el estrógeno se detiene o reduce la pérdida ósea en las mujeres [1]. Deficiencia de estrógenos provoca la osteoporosis, y, por tanto, disminuye la resistencia mecánica de la subchondral huesos pueden afectar indirectamente el cartílago articular [25]. También es bien sabido que los niveles séricos de estrógenos en los hombres es notablemente más bajo y no cambia significativamente a lo largo de su vida útil. Por el contrario, los niveles séricos de estrógenos en las mujeres es considerablemente mayor y disminuye significativamente después de la menopausia. Nuestros resultados muestran que el ER ER α y β se expresaron en la superficie articular en los hombres maduros y tanto inmaduras y hembras maduras. Debido a que el nivel de estradiol en plasma no fue diferente entre los jóvenes de sexo masculino (5 meses de edad) y el varón (24 meses de edad) rata [21], la diferencia de ER expresión que no se considera asociada con el proceso de envejecimiento. Los niveles de ER ER α y β en la que el cartílago articular de las ratas OVX, como una simulación de postmenopause, así como los niveles de ER α en ratas hembras de edad resultaron ser reducido. Estos resultados sugieren que los estrógenos y la ER α expresión afectan directamente el metabolismo del cartílago durante toda la vida, independientemente de si o no este efecto es beneficioso. Los resultados mostraron la presencia de RE en la que el cartílago articular de la carga mediante la utilización conjunta de la tinción de inmunofluorescencia. Estos resultados aportan datos básicos que faciliten una mayor investigación sobre la relación entre OA, el envejecimiento, el sexo, los estrógenos, y RE.

Esta obra fue financiada en parte por subvenciones de Investigación Científica del Ministerio de Educación, Ciencia, Deportes, Cultura y Tecnología, Japón (KM y MK).