Acta Histochemica et Cytochemica, 2007; 40(1): 1-7 (más artículos en esta revista)

La apoptosis en el embrión de Medaka la temprana etapa de desarrollo

Sociedad Japonesa de Histoquímica y Citoquímica
Norio Iijima [1], Takahiko Yokoyama [1]
[1] Anatomía y Biología del Desarrollo, Kyoto Prefectural University of Medicine, 465 Kajii-cho-Kawaramachi Hirokoji, Kamigyo-ku, Kyoto 602-0841, Japón

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Resumen

La apoptosis es un acontecimiento importante del desarrollo de diversos órganos. En este estudio, hemos utilizado in situ Terminal Deoxynucleotidyl Transferase mediada por dUTP nick de fin de etiquetado (TUNEL) para visualizar la distribución temporal y espacial de la apoptosis en el embrión en desarrollo medaka, que es un modelo útil para el desarrollo de la biología y la genética. La mayoría de las células apoptóticas se distribuyeron en el sistema nervioso central y tailbud. En el cerebro y la retina, la mayor parte de la apoptosis se produjo en el período de restricción. Hibridación in situ contra la caspasa 3 y caspasa 3B mostró que estos se distribuyeron en los tailbud y la cabeza, respectivamente. Estos resultados sugieren que dos tipos de caspasa 3 estuvieron involucrados en la apoptosis en diferentes áreas.

I. Introducción

Desarrollo muerte celular programada es un acontecimiento importante en la morfogénesis de casi todos los tejidos y órganos, junto con la proliferación celular, diferenciación celular y coordinada migración celular [18, 20]. En el desarrollo, el exceso de células se producen durante la morfogénesis y luego eliminados. Durante este traslado, las células mueren revelan una muy conservadas morfológicas proceso, mostrando el encogimiento celular, blebbing membrana nuclear, condensación nuclear y la fragmentación secuencial. Esa muerte celular se define como la apoptosis. La apoptosis es que se sabe están bajo el control de un rígido programa regulado genéticos. En muchos animales, hay varios eventos de señalización de la apoptosis. Estas señales, que pueden ser derivados de los receptores de muerte, el estrés oxidativo o la radiación daño, convergen en la caspasa 3, que desempeña un papel directo terminador. En medaka, dos tipos de caspasa 3 se han encontrado [8, 9].

En el pez cebra, un modelo útil para la biología del desarrollo, muchos mutantes se ha informado, algunas de las cuales presentan anormalidades en el desarrollo de muerte celular [1, 5, 12]. El desarrollo de apoptosis se ha descrito en el pez cebra [2, 3]. Sin embargo, existe una escasez de información sobre la muerte de la célula de desarrollo de esta especie.

El medaka es otro modelo útil para estudiar la biología del desarrollo, las neurociencias y la genética. El medaka embrión es muy transparente, por lo que las anomalías de los órganos abdominales se ven fácilmente, en comparación con los de ratones. Una abundancia de mutantes medaka ha sido reportado. Anomalías de los órganos principales consisten en alteraciones de crecimiento, diferenciación celular, y el exceso o la falta de muerte celular programada. Comparación de la apoptosis en la organogénesis entre esos mutantes y de tipo salvaje medaka es importante. Sin embargo, el proceso de muerte celular en condiciones normales de desarrollo no se ha informado con precisión en el medaka. En este estudio, el proceso de muerte celular se describe cuantitativamente, y se describe la expresión de un tipo de caspasa 3, que es una enzima clave en la apoptosis.

II. Materiales y Métodos
Peces cepa y embriones

Este estudio se realizó a través de Cab cepa, un convencional de tipo salvaje cepa de medaka (Oryzias latipes). Medaka huevos fueron recolectados de una colonia de laboratorio. Los embriones fueron incubadas a 27 ° C después de su recogida, y se organizaron de acuerdo a Iwamatsu [7]. Con el fin de comparar la muerte celular espontánea en el desarrollo a la muerte celular en virtud del daño, hemos adoptado luz ultravioleta (UV)-embriones expuestos medaka, en la que fue la apoptosis inducida por la radiación UV. Para el muestreo de luz ultravioleta UV-medaka embriones expuestos, los embriones en la etapa 17 fueron expuestos a los rayos UV (UV-C, 254 nm) en una dosis de energía de 180 mJ / cm 2 por una crosslinker UV (UV Stratalinker 2400, Stratagene, La Jolla, CA, EE.UU.). Veinte horas después de la radiación UV-, los embriones fueron fijados de la siguiente manera.

Preparación de tejidos

Los embriones fueron fijadas con 4% paraformaldehído (PFA) en 0,1 M tampón fosfato durante 4 horas a temperatura ambiente. Después de 3 horas de fijación, los embriones fueron dechorionated y la yema de los sacos fueron retirados en la PFA en tampón fosfato. El fijo embriones se lavaron dos veces en el 0,1% Tritón X-100 en-buffer fosfato salino (SAFT) y transferir progresivamente al 100% de metanol a través de una serie de metanol (25, 50, 75% metanol) para la deshidratación. Actividad de peroxidasa endógena se quenched con el 0,3% de H 2 O 2 en el 100% de metanol durante 30 minutos a temperatura ambiente.

La detección de células apoptóticas en su conjunto se monta

La fragmentación de ADN nuclear de apoptosis se detectó por el método TUNEL (Terminal Deoxynucleotidyl Transferase mediada por dUTP nick-end etiquetado), utilizando una apoptosis in situ kit de detección (Takara, Shiga, Japón). Rehidratada embriones que habían pasado por una serie de metanol (75, 50, 25% metanol), fueron enjuagar tres veces con PBST. Los embriones fueron incubadas con solución de etiquetado, que contiene deoxynucleotide terminal transferasa y dUTP-conjugado con FITC, durante 90 min a 37 ° C. Después de tres lavados con PBST, estas muestras se reaccionó con FITC anti-anticuerpo conjugado con peroxidasa de rábano a 4 ° C durante la noche. Apoptosis se visualiza con 3,3 '-Diaminobencidina tetraclorhidrato (Dojin, Kumamoto, Japón) como cromógeno. Manchadas embriones fueron deshidratados con acetona y embebidas en Technovit 8100 (Heraeus Kulzer, Wehrheim, Alemania). Serial secciones, 5 μ m de espesor, fueron tomadas cada tres secciones y teñidas con methylgreen (Wako, Osaka, Japón). El número de TUNEL-positivas las células se había contado en las secciones de cuatro embriones para cada etapa del grupo.

Todo el montaje hibridación in situ

Todo el montaje hibridación in situ se realizó a través digoxigenina (DIG) marcado con sondas contra el RNA caspasa-3A mRNA y caspasa 3 B mRNA. Se utilizó EST clon MF01FFA032p01 y MF01FSA0333p01, lo que correspondía a la caspasa 3 y caspasa 3B, respectivamente [8, 9]. Los embriones fueron fijados para el 3 hr en PFA 4% a temperatura ambiente. Los embriones fueron fijados dechorionated, lavados dos veces en el 0,1% de Tween-20 en buffer fosfato salino-(PBSTw), y transferir progresivamente al 100% de metanol a través de una serie de metanol (25, 50, 75% metanol) para la deshidratación. Los embriones fueron deshidratados rehidratada luego de la transferencia de SAFT a través de una serie invertido metanol (75, 50, 25% de metanol). Después de lavar dos veces en PBSTw, los embriones fueron tratados con proteinasa K (Roche, Basilea, Suiza, 10 μ g / ml en PBSTw) durante 5-10 min y refixed durante 20 min a 4% PFA a temperatura ambiente. Tras varios lavados con PBSTw, los embriones fueron prehybridized para 4 Horas de amortiguación en la hibridación (50% formamida, el 0,1% de Tween-20, 50 μ g / ml tRNA, 50 μ g / ml heparina, 2 × SSC) a 70 ° C, y luego hibridizada la noche a la mañana con la etiqueta DIG-sentido o RNA antisentido sonda (100-200 ng / ml) en el buffer de hibridación a 70 ° C. El hibridizada embriones se lavaron cuatro veces en el 50% formamida / 2 × SSC durante 30 minutos cada hora a 70 ° C, dos veces en 2 × SSC durante 15 minutos cada hora a 70 ° C, dos veces a 0,2 × SSC durante 20 minutos cada vez a 70 ° C, y tres veces en PBSTw durante 10 minutos cada tiempo a temperatura ambiente. Después los embriones fueron bloqueadas por 1 hora de incubación con el 1% de bloqueo agente (Roche) en PBSTw a temperatura ambiente, se incubaron durante la noche a 4 ° C con 1/5000-diluted anti-DIG anticuerpo conjugado con fosfatasa alcalina (Roche) en PBSTw. Después de seis lavados en PBSTw durante 30 minutos cada hora a temperatura ambiente, los embriones fueron lavados tres veces en NTMT (100 mM NaCl, 100 mM Tris-HCl pH 9,5, 50 mM MgCl 2, 0,1% Tween-20) durante 10 min cada vez a temperatura ambiente. Por último, los embriones fueron incubadas en NTMT que contiene 3,5 μ l NBT (4-nitro azul tetrazolio cloruro, Roche, 100 mg / ml) y 3,5 μ l de BCIP (5-bromo-4-cloro-3-fosfato indolyl, Roche, 50 mg / ml) por 1 ml, en la oscuridad. El color embriones fueron lavados varias vez en PBSTw y fotografiados en un 2% metilcelulosa.

III. Resultados
Detección de la muerte de las células apoptóticas por el método TUNEL

TUNEL-positivas se detectaron células en todas las etapas en que los embriones fueron incluidos en la muestra. Especialmente en la zona de la cabeza en la etapa 24 y cola yema en la etapa 27, muchos de color marrón oscuro se observaron señales de microscopio binocular. En la cabeza, relativamente grande de partículas se encontraron en el cerebro (Fig. 1 A). Por el contrario, en los embriones expuestos a la luz ultravioleta, TUNEL se detectaron señales en todo el embrión como muchos pequeños puntos. Las grandes partículas, como se detectó en el desarrollo normal en la etapa 24, no se detectaron. (Fig. 1 B). En el tailbud, TUNEL-positivas las células aumentaron de 23 a etapa etapa 27. TUNEL se detectaron señales en todo el embrión como muchos pequeños puntos (Fig. 2 A, B, C).

Observación microscópica demostró que TUNEL-positivas las células tenían un redondeadas o disminuido y forma. Gran número de TUNEL-positivas las células se encontraron en el sistema nervioso central en comparación con otros tejidos. Especialmente en la etapa 24, en apoptosis agrupaciones formadas en el cerebro y la retina (Fig. 1 D, F). El tamaño de los grupos contiguos oscilaban entre dos y diez células. En otras zonas que contienen la médula espinal y tailbud, las agrupaciones de la apoptosis no se encontraron. La mayoría de TUNEL-positivas las células se localizan en el cerebro y la médula espinal. Una reducción moderada del número de células apoptóticas se detectaron en la retina y somites o al derecho indiviso myotomes (Fig. 1 J, K). Menor número de células apoptóticas se detectaron en la vesícula ótica (Fig. 1 G, H), órgano digestivo (Fig. 1], células epidérmicas de yema (datos no presentados), lente (Fig. 1 C) y notochord (datos no se muestra).

En el hindbrain, en el que un gran número de células apoptóticas se detectaron, la dinámica de la apoptosis se observaron en el desarrollo. En la etapa 24, firmemente TUNEL-positivas se detectaron células (Fig. 3]. Un estudio cuantitativo de TUNEL-positivas demostró que las células apoptóticas las células situadas en los tejidos, los cuales se obtuvieron a partir de tubo neural, constituyen el 50-80% del total-TUNEL células positivas en cada uno de los embriones. En las etapas 20 y 22, el número de TUNEL-células positivas en el forebrain, cerebro medio, hindbrain retina y son pequeños, sino que aumentó en la etapa 23 o 24 a un pico, y luego disminuyó (Fig. 4]. En el sistema nervioso central, a lo largo de dorsal-ventral del eje, claras diferencias en las cifras de muerte celular no fue detectado. No hay diferencias en el número de muerte celular se encuentra entre la superficie de todo el ventrículo, en el que las células progenitoras neuronales se encontraban, y otras áreas. En los somites y myotome indivisa, un pariente gran número de células apoptóticas se observó en la etapa 23 (Fig. 4].

Localización de caspasa 3 y caspasa mRNA 3B mRNA

Caspasa 3A ARNm se localizan en la tailbud. Se detectó débilmente en la etapa 20 (Fig. 5 A). Expresión de la caspasa 3 mRNA fue más fuerte en la etapa 24 (16-somite etapa; Fig. 5 E, F). En las etapas 27, expresión de la caspasa 3 mRNA fue más débil de lo que en la etapa 24 (Fig. 5 G). En contraste, la caspasa 3 B mRNA fue ampliamente expresada en la zona de cabeza, y su expresión no se limita a determinados órganos o tejidos. La porción posterior del cuerpo expresó caspasa 3B ARNm más débilmente. Expresión de la caspasa 3 B mRNA aumentó de 20 a etapa etapa 27 (Fig. 6 A, C, E).

IV. Discusión

En este estudio, hemos obtenido una visión general de TUNEL-positivas muerte celular en embriones medaka. Dos notablemente TUNEL-manchado zonas se encontraron, la cabeza y el tailbud. Contar TUNEL-positivos de células mostró la dinámica de la muerte de las células apoptóticas en la cabeza. En el forebrain, cerebro medio, hindbrain y retina, que se derivan del tubo neuronal, marcados picos de TUNEL-positivas se detectaron células. En la etapa 23 (de 12 somite etapa) y etapa 24 (16-somite etapa), el número de células apoptóticas aumentado rápidamente y alcanzó su punto máximo. La mayoría de las muertes de células apoptóticas en la cabeza zona se encuentra en el cerebro. En el tailbud, una gran cantidad de apoptosis se detectó en la etapa 27. Estos resultados fueron similares a los informes de la apoptosis en los embriones de pez cebra [3]. Las agrupaciones de células apoptóticas también han sido observados en embriones de pez cebra y otros animales [3, 10]. En estos informes, se especuló que sean causados por déficit de los cruces, lo que podría coordinar las actividades de los circuitos neuronales transitorio antes de inervación de sus axones [15, 16]. Estas cruces podría determinar el destino de las células situadas cerca de morir en las células de embriones medaka. Se piensa que las señales involucradas en la muerte celular podría ser transferido de morir a las células vecinas, aunque las células brecha cruces. En los embriones expuestos a la luz ultravioleta, en la que la muerte celular no es fisiológico, las agrupaciones de células apoptóticas no se encontraron. Si bien esto plantea la posibilidad de que el mecanismo de unión de células suerte tal vez no se han desarrollado entre las células apoptóticas bajo irradiación ultravioleta, la razón de la presencia de estas agrupaciones de desarrollo restringido en períodos no es precisamente entendido.

También se visualizan medaka caspasa 3 ARNm (mRNA caspasa 3A y 3B caspasa ARNm). Caspasa 3 y caspasa 3B se expresaron en la tailbud y la zona de la cabeza, respectivamente. En general, la caspasa 3 es una enzima clave para la muerte de las células apoptóticas, y es reconocido como un terminador de células para ser asesinados. Curiosamente, la caspasa 3-dominante zonas coincidió con las áreas en las que una gran cantidad de apoptosis producido. De este modo, se piensa que la muerte celular en medaka desarrollo depende de caspasa 3 y caspasa 3B. En el pez cebra, caspasa 3 se expresó a lo largo del embrión en cada etapa de desarrollo [21]. Cuando la caspasa 3 es más de-expresado mediante la introducción de su cDNA en huevos de pez cebra, se amplia la apoptosis inducida [21]. Se especuló que, en el medaka como en el pez cebra, los patrones de expresión de desarrollo de la caspasa 3 de genes regulan la distribución espacial de células apoptóticas en el área de cabeza y tailbud. Sin embargo, el mayor número de TUNEL positiva de células apareció en la etapa 24 en la cabeza, con el pico de expresión de la caspasa 3B en la cabeza que ocurren en la etapa 28. Por lo tanto, la cantidad de caspasa 3 mRNA por sí solo no estrictamente determinar la frecuencia de la muerte celular en el desarrollo.

En la caspasa 3 knock-out ratones, el exceso de células neuronales se produce a cerrar el tercer ventrículo [10, 17, 22]. Esto sugiere que la muerte celular neuronal en los países en desarrollo forebrain depende de la caspasa 3. El exceso de células progenitoras de células neuronales [4]. Sin embargo, en este estudio, el área alrededor del ventrículo, en la que muchas células progenitoras neuronales se encuentra, no contiene más que las células apoptóticas en otras zonas del cerebro.

En el sistema nervioso en desarrollo, el mecanismo de muerte celular no se ha dilucidado completamente. En cuanto a los factores desencadenantes de la apoptosis, la proteína morfogénica ósea, que se produce desde el techo de la placa del tubo neural, y sonic erizo, que se produce a partir de la palabra de la placa del tubo neural y de la notochord, se han notificado a ser una señal de muerte y una señal de supervivencia, respectivamente [6, 11, 13, 19]. Cell-a-la comunicación celular mediada por Notch se informó a funcionar como una señal de supervivencia [14]. En el medaka, la contribución de estos factores a la muerte celular neuronal es desconocida. Los estudios futuros se puede esperar para aclarar la muerte de las células neuronales en el cerebro medaka.

Estamos agradecidos al Dr K. Naruse (Universidad de Tokio) para proporcionar la amabilidad de la EST clon de ADN de caspasa 3 y caspasa 3B, y K. Oka gracias por su ayuda en los trabajos de laboratorio. Esta investigación fue apoyada por subvenciones del Ministerio de Educación, Cultura, Deportes, Ciencia y Tecnología de Japón.