Acta Histochemica et Cytochemica, 2007; 40(1): 19-26 (más artículos en esta revista)

Localización preferencial de Rat GAPDS en las costillas de fibra envolventes flagelo de los espermatozoides y su expresión durante Flagellar Formación

Sociedad Japonesa de Histoquímica y Citoquímica
Ichiro Tanii [1], Tetsuya Yagura [2], Naoyuki Inagaki [2], Tatsuo Nakayama [3], Kazunori Imaizumi [1], Kazuya Yoshinaga [1]
[1] División de Biología Molecular y Celular del Departamento de Anatomía, Facultad de Medicina, Universidad de Miyazaki, Miyazaki 889-1692, Japón
[2] División de transducción de señales, Escuela de Estudios Superiores de Ciencias Biológicas, del Instituto Nara de Ciencia y Tecnología, Ikoma 630-0101, Japón
[3] Departamento de Ciencias de la Vida, Frontier Science Research Center, Universidad de Miyazaki, Miyazaki 889-1692, Japón
[4] Departamento de Biología de Medicina, Escuela de Estudios Superiores de Medicina y Ciencias Farmacéuticas, Universidad de Toyama, 2630 Sugitani, Toyama 930-0194, Japón

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Resumen

El correcto montaje de esperma flagellar proteínas es fundamental para la motilidad espermática. El esperma y espermátida isoforma-específicos de glyceraldehyde 3-fosfato deshidrogenasa, GAPDS, flagellar es una proteína indispensable para flagellar movimiento de los espermatozoides. Para obtener información sobre el montaje de la enzima glicolítico en el flagelo, la precisa localización de rata GAPDS en el flagelo y la fase de incorporación al flagelo fueron examinados utilizando un anticuerpo monoclonal. Immunolocalization de rata GAPDS se limitaba a la vaina fibrosa (FS) en los espermatozoides flagelo, y es predominante en la circunferencia costillas en lugar de la longitudinal columnas. Inmunoreactividad se detectó por primera vez en el citoplasma y los flagelos de paso-16 espermátidas durante la etapa final de formación FS. Junto con la expresión de otras proteínas FS, los presentes resultados indican la secuencia de montaje de componentes FS, lo que sugiere que la expresión y el transporte de GAPDS está regulado de manera coordinada durante la formación de espermatozoides flagellar.

I. Introducción

El correcto montaje de los componentes flagellar es esencial para la eficacia de flagellar movimiento de los espermatozoides a nadar hasta en lo que respecta al huevo para la fertilización. De hecho, un número de casos de displasia de FS, se han registrado en los hombres estériles asthenozoospermic [2]. En este sentido, es de interés para determinar si la síntesis, el transporte y la incorporación en el flagelo de flagellar proteínas están reguladas en coordinación con la construcción del marco flagellar citoesqueleto. El proceso de la biogénesis del flagelo ha sido cuidadosamente analizado en la rata en un estudio microscópico de electrones en la morfogénesis de SL en espermátidas de rata ha demostrado que la secuencia del montaje de la estructura [6]. FS está compuesto por dos columnas longitudinal y transversal numerosas costillas conectar las columnas. La longitudinal columnas desarrollar en los primeros meses de spermiogenesis las costillas y luego emerge y se desarrollan durante la tarde spermiogenesis [6]. Durante el período de desarrollo de FS, las proteínas recién sintetizadas se incorporen en los países en desarrollo FS [6]. Sin embargo, la expresión y de reunión de rata FS componentes durante spermiogenesis no se han examinado con precisión a excepción de A-proteína quinasa de anclaje 4 (AKAP4) [15] y específicas de tejido testicular thioredoxin-2 (SPTRX-2) [11].

El ratón y la rata y su GAPDS humanos orthologue (GAPD2) son el único isoenzima de glyceraldehyde-3-fosfato deshidrogenasa en el esperma [3, 20 - 22]. GAPDS está íntimamente asociada con la vaina fibrosa y proporciona la mayor parte de la fuente de energía para la motilidad espermática [10]. En este contexto, el proceso de incorporación de GAPDS en FS durante flagellar formación será un valioso modelo de la asamblea de proteínas no estructurales en FS. Los objetivos del presente estudio son examinar la localización precisa de rata GAPDS y determinar su secuencia temporal de expresión durante el desarrollo flagellar. Los resultados muestran que la rata es GAPDS preferentemente incorporado en las costillas de SL durante la etapa final de la formación FS.

II. Materiales y Métodos
Animales

Ratas Wistar y ratones BALB / c se permitió el libre acceso a los alimentos y el agua. Los ratones fueron sacrificados por dislocación cervical y se sacrificaron las ratas después de ser anestesiados con éter. Todos los experimentos fueron aprobados por el Comité de Investigación Animal de la Universidad de Miyazaki.

Preparación del anticuerpo monoclonal

El método de producción de anticuerpos monoclonales se ha descrito anteriormente [17]. En resumen, las células testiculares de 12 días de edad, las ratas fueron tratadas con no-iónicos débil de detergente, 40 mM n-heptyl-β-D-thioglucoside (Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Japón) en hielo durante 10 min. El extracto fue centrifugada a 20000 g durante 30 min a 4 ° C y el sobrenadante resultante se utilizó como inmunógeno. De mujeres adultas Balb / c. Los animales fueron vacunados por vía subcutánea. Spleen células se obtuvieron de los ratones inmunizados y fusionados con NS-1 células de mieloma. El anticuerpo monoclonal obtenido se denomina MC321 (IgM).

Ascitis que contengan MC321 fueron obtenidos por inyección de anticuerpos que producen las células del hibridoma en Balb / c ratones hembra. MC321 fue purificado de la ascitis de Mono Q (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, EE.UU.) cromatografía en columna. Por inmunohistoquímica, microscopía immunoelectron, y el Western Blot, MC321 fue utilizado en una dilución de 1:80 gastado el medio de cultivo.

Antígeno la extracción y el Western Blot

Testículos de 12 días de edad y ratas adultas fueron disecados y suspendido en 20 mM Tris-HCl (pH 7.4), 150 mM NaCl, 2 mM de ácido etilendiaminotetracético (EDTA), 0,5 mM 2-mercaptoetanol, y los inhibidores de la proteasa que contienen 1 mM PMSF ( Sigma Chemical Co, St Louis, MO, EE.UU.), 5 μ g / ml leupeptina (Peptide Institute, Osaka, Japón), 5 μ g / ml pepstatin A (Peptide Institute), y 5 μ g / ml aprotinina (Nacalai Tesque, Kyoto, Japón). Para obtener el citosol de las células testiculares, las células fueron perturbadas por la descompresión de nitrógeno con Parr Cell Interrupción Bomb (Parr Instrumento Company, Moline, IL, EE.UU.). La presión se mantuvo en 900 psig durante 20 min en hielo. Homogeneizado se centrifugó a 1500 g durante 10 minutos, seguido a 20000 g durante 40 min. El resultado se mezclaron con igual volumen de 2 × SDS-muestra una solución tampón que contiene 0,25 M Tris-HCl (pH 6.8), SDS 4%, 10% 2-mercaptoetanol, y el 10% de sacarosa. Sperm proteínas se obtuvieron a partir de la rata epididymides cauda de extracción con SDS-buffer muestra a 100 ° C durante 3 min. Después de hervir durante 3 min, las muestras fueron sometidas a la página en 7,5% la separación de geles. Las proteínas fueron trasladados a polyvinylidiene fluoruro (PVDF) membranas. Los blots fueron luego probaron con MC321.

El busulfano tratamiento

El busulfano (10 mg / kg de peso corporal), un agente citotóxico que destruye la mayor parte del tallo espermatogonias, se administró a ratas adultas de la inyección intraperitoneal, tal como se describe anteriormente [7]. Aproximadamente 24 días después de la inyección de una dosis única del agente, se recupera la espermatogénesis. En los testículos en los 58 días después de la inyección de busulfano, paso-8 espermátidas comprende los de mayor población diferenciados de las células espermatogénica y más tarde todas las espermátidas en los pasos 9-19 estuvieron ausentes. Las ratas fueron asesinados tras el tratamiento y los testículos fueron extirpados.

Depuración parcial y la identificación de los 64-kDa de proteínas antigénicas

Una columna immunoaffinity fue preparado por entrecruzamiento de MC321 con Affigel 10 (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA, EE.UU.), con arreglo a las instrucciones del fabricante. Los extractos testiculares se aplicaron a la MC321-immunoaffinity columna equilibrada con PBS. La columna es lavar muy bien la columna con 20 volúmenes de PBS. Las proteínas específicamente vinculado a la columna se eluye la elución con una solución tampón que contiene 50 mM glicina (pH 2.5), 0,15 M NaCl, 2 mM EDTA, y los inhibidores de la proteasa.

Para identificar la proteína antigénica para MC321, las proteínas aisladas de la MC321-immunoaffinity cromatografía se resolvieron en un SDS-7,5% en gel de poliacrilamida y visualizar de Coomassie brillante coloración azul. Porciones del gel que contiene una proteína inmunorreactiva fueron extirpados, y luego digiere con tripsina tal como está descrita anteriormente [14]. Péptidos eluye de gel piezas fueron analizadas por la matriz con ayuda de láser desorción / ionización tiempo de vuelo (MALDI-TOF) espectrometría de masas (MS) utilizando un sistema Voyager Elite (Applied Biosystems, Tokio, Japón). Identificada péptidos se compararon con las secuencias de péptidos anotado regiones codificantes de la aplicación de la mascota programa de búsqueda.

Immunoelectron microscopía

Pareja testículos de ratas han sido fijadas por la perfusión del 4% de paraformaldehído +0,3% glutaraldehido en 0,1 M tampón fosfato (PB, pH 7.4) a través de la arteria testicular y, a continuación, inmersos en el mismo fijador la noche a 4 ° C. Los especímenes fueron incorporados en Lowicryl K4M. Ultrathin secciones en las rejillas de níquel se inmunoelectrónica etiquetados para microscopía electrónica, tal como se describe [18]. MC321 fue utilizada como uno de los principales anticuerpos, y de 15 nm de oro antimouse conjugado de anticuerpos IgM (EY Laboratories Inc, San Mateo, CA) fue utilizado como anticuerpo secundario en una dilución 1:200. Control de los experimentos se llevaron a cabo mediante la sustitución de la primaria con anticuerpos IgM normal del ratón o PBS. Counterstaining se hizo utilizando el acetato de uranilo / metil celulosa solución [16]. Las secciones se observaron bajo un microscopio electrónico de transmisión (Hitachi modelo H7100, Tokio, Japón) a una tensión de aceleración de 75 kV.

Immunohistocytochemistry

Rat tejidos se fijaron con Bouin del fijador de perfusión a través de la aorta torácica y embebidos en parafina. La tinción de inmunoperoxidasa se realizó en deparaffinized secciones, tal como se describe [17]. MC321 fue utilizada como uno de los principales anticuerpos. Control de los experimentos se llevaron a cabo mediante la sustitución de la primaria con anticuerpos IgM normal del ratón o PBS. Algunas secciones se counterstained con hematoxilina, u observado con Nomarski de contraste diferencial de interferencia, sin counterstaining. Ácido periódico de Schiff (PAS) manchadas consecutivos secciones se han utilizado para la identificación de las etapas del ciclo del epitelio seminífero, según la clasificación de Hess [5].

Espermatozoides se preparan a partir de la rata cauda epidídimo, lavados dos veces con PBS mediante centrifugación a 250 g durante 5 min, y adjunta a la diapositiva gafas de cytospin. Inmunoticción El procedimiento se describe más arriba.

III. Resultados
Western blot de los antígenos

Estamos anticuerpos monoclonales producidos mediante el uso de extractos de testículos de ratas inmaduras en postnatal día 12 como inmunógeno. Como resultado de ello, hemos establecido tres clones productoras de anticuerpos monoclonales, entre ellos MC321 [17].

El peso molecular del antígeno se determinó a través de Western Blot con MC321 (Fig. 1]. En los extractos testiculares de 12 días de edad, ratas, inmunorreactiva una banda de 77 kDa fue destacado y otro grupo menor fue detectado en una posición por encima del 77-kDa banda. Las proteínas citosólicas testicular preparado a partir de ratas adultas contiene dos proteínas inmunorreactivas en relación con las masas moleculares de 77 kDa y 64 kDa. En el esperma proteínas extraídas con un 2% de SDS, el 64-kDa banda fue la única inmunorreactiva.

Los diferentes orígenes de los dos antígenos en el testículo adulto

Dos proteínas antigénicas de 64-kDa y 77-kDa fueron detectados en el extracto testicular de ratas adultas (Fig. 1 b). Para determinar el origen de los antígenos, hemos utilizado el adulto los testículos en los 58 días después de la inyección de una dosis única de busulfano, en el que la mayoría de los alargándose espermátidas y espermatozoides testiculares fueron agotadas por el tratamiento (Fig. 2 A). En la parte occidental del blots del extracto de los tratados con busulfano testículos, el 77-kDa de proteínas fue destacado, mientras que el 64-kDa de proteínas apenas se detectaron (Fig. 2 B). Este resultado muestra que el 64-kDa proteína se deriva exclusivamente de los espermatozoides y alargándose espermátidas. Junto con la conclusión de que el 77-kDa banda fue destacado en los 12 días de testículos, el 77-kDa de proteínas es, presumiblemente, derivados de células de Sertoli, meióticas o células premeiotic espermatogénica.

Depuración parcial y la identificación de los antígenos 64-kDa de proteínas

Para aislar los antígenos, proteínas citosólicas testicular de ratas adultas fueron embarcados en una MC321-immunoaffinity columna, y las proteínas específicamente vinculado a la columna se eluye y luego analizados por SDS-PAGE y Western Blot. En el gel teñido de azul de Coomassie brillante (CBB), el 64-kDa de proteínas fue predominante, mientras que varios menores de proteínas en relación con las masas moleculares de 67 kDa y 39 kDa fueron detectados en el efluente (Fig. 3 A). Entre ellos, el 64-kDa de proteínas fue inmunorreactiva mientras que las otras proteínas no mostró inmunoreactividad. Inmunorreactiva una banda de 59 kDa se detectó en la zona occidental de blots, pero no correspondiente banda se encontró en la CBB manchadas de gel. Ni la banda de la broca ni manchados inmunorreactivas para la banda de 77-kDa proteína se detecta en el efluente. Para identificar el 64-kDa de proteínas, una parte de la 64-kDa gel banda fue eliminado y se presentará para su digestión proteolítica del péptido y la identificación de MALDI-TOF MS. Como resultado de ello, el 64-kDa de proteínas fue identificado inequívocamente como GAPDS (GenBank adhesión no. AJ297631) (Fig. 3 B, C).

Immunolocalization de GAPDS en el flagelo

Western blot indicó que la única molécula antigénica en la rata fue GAPDS espermatozoides (Fig. 1]. La inmunocitoquímica demuestra que GAPDS se limitaba a la pieza principal y no se ha encontrado en otros dominios de esperma, incluida la cabeza, midpiece y la pieza final de la rata espermatozoides del epidídimo (Fig. 4 A). La localización específica en la pieza principal se analizaron a finales de paso-19 espermátidas por correo-inmunoelectrónica incorporación de etiquetado para microscopía electrónica. Partículas de oro fueron preferentemente en la etiqueta que FS es una estructura específica en la principal pieza (Fig. 4 B-D). No fue etiquetado específico detectables en el exterior de fibra densa, axoneme y vaina mitocondrial. FS se compone de dos componentes distintos: el longitudinal y circunferencial columnas costillas. Partículas de oro parece ser predominante en las costillas y no en las columnas longitudinal (Fig. 4 C). Cuando contamos el número de partículas de oro en 200 secciones transversales de la pieza principal, la densidad de las partículas de oro en toda la zona de las costillas era de aproximadamente 3,8 veces mayor que en la zona longitudinal de la columna. En particular, la zona central de las columnas se longitudinal apenas marcado con partículas de oro (Fig. 4 C). No era de oro de etiquetado se indica en FS en el control de los experimentos (Fig. 4 E).

Expresión de los spermiogenesis durante GAPDS

A continuación se decidió la distribución y el cambio en la expresión de GAPDS en los testículos de adultos mediante técnicas de inmunohistoquímica. Inmunoreactividad se detectó en el citoplasma y los flagelos de alargándose espermátidas, así como en los lugares cerca de la membrana basal y alrededor de la cabeza de los topes de alargándose espermátidas (Fig. 5 A-E). Aunque varios sitios se inmunorreactiva, a juzgar por los resultados del experimento con los tratados con busulfano testículos (Fig. 2], la inmunoreactividad en el citoplasma y los flagelos de la alargándose espermátidas corresponde a GAPDS. La inmunoreactividad alrededor de la cabeza la tapa se supone que es localizado, ya sea a espermátida y / o células de Sertoli. Para determinar la localización exacta, posterior a la incorporación inmunoelectrónica tinción se realizó en el testículo. Partículas de oro se limita a la capa de actina ectoplasmic especialización en células de Sertoli (Fig. 6]. No o apenas etiquetado de oro fue encontrado en el núcleo y acrosoma de la alargándose espermátidas. Control de los experimentos no mostraron distintos oro etiquetado. El inmunorreactiva sitios cerca de la membrana basal corresponden a la sangre-testículo barrera que está formado por entre las cruces de Sertoli apretado. En este estudio, nos centramos en la secuencia temporal de la GAPDS expresión que figura en el citoplasma y el flagelo de las espermátidas alargándose. En los túbulos seminíferos en la etapa II, un débil immunoreaction fue detectable tanto en el citoplasma y los flagelos de los primeros paso espermátidas-16 (Fig. 5 A). En las primeras etapas, no fue detectable immunoreaction, ya sea en el citoplasma o flagelos de las espermátidas (Fig. 5 E). La intensidad del aumento de immunoreaction como spermiogenesis procedió (Fig. 5 B, C), alcanzó un máximo a finales de paso-17 espermátidas en la fase V-túbulos seminíferos (Fig. 5 C), y persiste hasta la fase terminal de spermiogenesis (Fig. 5 D). No se encontró inmunoreactividad en el núcleo de las células en todo el testículo, ni en el citoplasma de las espermatogonias, espermatocitos, peritubular myoid células, las células de Leydig, o los vasos sanguíneos. El control de las secciones con la preimmune suero no mostraron inmunoreactividad (Fig. 5 F).

IV. Discusión

A pesar de que el anticuerpo utilizado en este estudio reconoce dos proteínas de 64 kDa y 77 kDa en los testículos de ratas adultas, el origen del 64-kDa de proteínas fue diferente a la del 77-kDa de proteínas por el experimento utilizando el busulfano tratados con testículos de ratas , Lo que demuestra que el 64-kDa proteína se deriva exclusivamente de esperma y espermátidas. Espectrometría de masas demostraron que el 64-kDa de proteínas es GAPDS. En estos análisis, el anticuerpo puede ser utilizado como una herramienta para la localización precisa y la expresión de rata GAPDS.

Nuestro inmunoelectrónica electrones estudio microscópico mostró una preferencia de etiquetado de rata GAPDS en la circunferencia costillas en lugar de longitudinal en la columna de SL. Sin embargo, un estudio previo informado de que el ratón GAPDS distribuye en ambas columnas y las costillas [3]. La discrepancia se debe probablemente a los métodos utilizados para la localización de las enzimas. El pre-incorporación de tinción de inmunoperoxidasa método utilizado en el estudio anterior no es suficiente para el análisis cuantitativo. Al igual que en ratas GAPDS, AKAP3/FSP95 es predominantemente localizada a las costillas en el esperma humano y espermátidas de incorporación posterior a la inmunoelectrónica microscopía electrónica [9]. Ropporin y AKAP asociada a las proteínas del esperma (ASP) han sido identificados como AKAP3 proteínas de unión de los dos híbridos de levadura sistema [1]. Ambas proteínas comparten una fuerte secuencia similarlity con la AKAP vinculante dominio de la reglamentación (RII α) de la subunidad A-kinasa. Ropporin también ha sido identificada como una proteína de unión de rhophilin, que es un putativo abajo objetivo de Rho, un pequeño GTPase [4]. Estos hallazgos sugieren que AKAP3 compartmentalizes algunas vías de señalización incluidos Rho y A-cinasa en las costillas. Sobre la base de la localización preferencial en la costilla, GAPDS pueden contribuir a la señalización asociados con AKAP3.

En cuanto a las otras proteínas FS, AKAP4, espermatogénica de células específicas de tipo 1 hexokinase (HK1-S) y de calcio vinculante fosforilación de la tirosina regulada de proteínas (CABYR) se distribuyen en todo el FS [8, 12, 13]. Post-que encaja inmunoelectrónica método fue utilizado para la localización de AKAP4 y CABYR, pero antes de la incorporación de tinción de inmunoperoxidasa se aplicó para la localización de HK1-S, por lo tanto, la localización precisa de la enzima es desconocida. Ropporin y rhophilin han demostrado ser distribuidos en los exteriores e interiores de las superficies de FS de pre-etiquetado que encaja inmunoelectrónica [4]. Sin embargo, en vista de la permeabilidad de la sonda, la precisa localización de estas proteínas dentro de la estructura sigue sin determinarse. A nuestro entender, la localización de los otros componentes FS no ha sido estudiado en el microscopio de electrones.

El presente estudio indica que ratas GAPDS se expresa y se incorpora a FS durante los pasos finales 16-19 de finales de spermiogenesis. Nuestros datos apoyan un reciente informe que describe a grandes rasgos la expresión de GAPDS en espermátidas de rata pero, por desgracia, no describe la primera aparición de GAPDS en el flagelo en el desarrollo de espermátidas [22]. Al comparar la expresión y la incorporación de rata GAPDS en el flagelo con la biogénesis del SL y la expresión de otros componentes FS en la rata, los presentes resultados nos permiten documentar la expresión temporal de GAPDS en asociación con el proceso de montaje de los componentes FS . La primera costilla Anlagen surge en el paso 11 y el final del desarrollo morfológico de las costillas se estima que ocurren alrededor de 15 durante el paso de rata spermiogenesis convencionales en un estudio microscópico de electrones [6]. Simultáneamente con el desarrollo morfológico, la incorporación de las nuevas proteínas sintetizadas en las costillas se observó exclusivamente durante los pasos 11-15 [6]. AKAP4 se detectó por primera vez en el citoplasma de paso-9 espermátidas y en el flagelo de paso-10 espermátidas, y el máximo inmunoreactividad en el flagelo se muestra en el paso-15 y más tarde en espermátidas de rata [15]. Tomados en conjunto, una gran parte de los componentes FS se monta en el plazo hasta el paso 15. Sobre la base del período de expresión, GAPDS se incorpora en las costillas después de las principales citoesqueleto arquitectura de las costillas ya se ha construido. Del mismo modo, SPTRX-2 se expresa en los pasos finales 15-19 de spermiogenesis en la rata [11]. Por otra parte, el ratón glicolítico enzimas, GAPDS y HK1-S, mostrar una expresión similar temporal durante los pasos finales de spermiogenesis [3, 12]. Aunque los datos son todavía limitados, estos resultados sugieren que los no estructurales FS componentes con actividad enzimática, como GAPDS, HK1-S y SPTRX-2, es más probable que se manifiesten durante los últimos pasos de spermiogenesis después de la mayor parte de FS componentes que ya se ha reunido para formar el citoesqueleto marco.

Entre los pacientes con displasia de FS (DFS) y controles normales, no cuantitativa o cualitativa de las diferencias, ya sea en AKAP4 o AKAP3 aún no han sido reportados [19]. Esto sugiere que hay factores que causan la DFS distintos de mutación en genes que codifican las proteínas estructurales, como AKAPs. Por otro lado, la mutación en los genes que afectan a la expresión, el transporte y embalaje de componentes FS se supone que es responsable de la DFS. El presente estudio se dirigió a la etapa precisa del montaje de un enzima glicolítico, GAPDS, en FS durante spermiogenesis, lo que indica que hay factores que regulan el caso secuencial de la formación FS. La acumulación de más datos sobre el montaje de cada componente FS ayudará a identificar con precisión los factores que regulan la secuencia de montaje, dando lugar a una mejor comprensión de la genética molecular y la base de flagellar normal proceso de montaje, así como las causas subyacentes de la DFS.

Este trabajo fue apoyado en parte por una subvención de Investigación Científica del Ministerio de Educación, Cultura, Deportes, Ciencia y Tecnología de Japón. Un agradecimiento especial se debe a Yasunori Fujii por su excelente asistencia técnica. Agradecemos las sugerencias de Akio Inoue de la Universidad de Osaka y Kazuo Kitamura de la Universidad de Miyazaki.