Acta Histochemica et Cytochemica, 2006; 39(2): 55-60 (más artículos en esta revista)

Lysophospholipid receptores son expresados diferencialmente en ratas células de Schwann terminal, tal como se desprende de una única célula RT-PCR y la hibridación in situ

Sociedad Japonesa de Histoquímica y Citoquímica
Hiroaki Kobashi [1], Takeshi yaoi [1], Ryo Oda [2], Seiichiro Okajima [2], Hiroyoshi Fujiwara [2], Toshikazu Kubo [2], Shinji Fushiki [1]
[1] Departamento de Patología y Neurobiología Aplicada, Escuela Superior de Ciencias Médicas, Kyoto Prefectural University of Medicine, Kawaramachi-Hirokoji, Kyoto 602-8566, Japón
[2] Departamento de Ortopedia, Escuela de Estudios Superiores de Ciencias Médicas, Kyoto Prefectural University of Medicine, Kawaramachi-Hirokoji, Kyoto 602-8566, Japón

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Resumen

Terminal células Schwann (TSCs) que cubren las terminales neurona motora, se sabe que juegan un papel importante en el mantenimiento de los cruces neuromuscular, así como en el proceso de reparación después de lesión del nervio. Sin embargo, las características moleculares de TSCs siguen siendo desconocidos, debido a las dificultades en el análisis de ellos debido a su escasez. Al utilizar nuestro método ya se ha informado de forma selectiva y eficiente la recogida de TSCs, hemos analizado la diferencia en los patrones de expresión de lysophospholipid (LPL) los genes del receptor (LPA 1, LPA 2, LPA 3, S1P 1, S1P 2, S1P 3, S1P 4, S1P y 5) entre TSCs y myelinating células de Schwann (MSC). LPL, que incluye lysophosphatidic ácido (LPA) y sphingosine 1-fosfato (S1P), es el de lípidos bioactivos que induce una gran variedad de respuestas celulares a través de determinados miembros del G-proteína unida a los receptores LPA. Resultó que LPA 3 sólo se expresó en TSCs, mientras que S1P 1 se expresó en TSCs y músculo esquelético, pero no en MSC. Otros tipos de LPL genes del receptor, incluida la LPA 1, S1P 2, S1P 3, S1P 4, se expresaron en ambos tipos de células de Schwann. Ninguno de los LPL gen del receptor de la familia mostró MSC-expresión concreta.

I. Introducción

Lysophospholipid (LPL) es un fosfolípido molécula de señalización y sus funciones que se han reportado hasta ahora incluyen la proliferación celular, myogenesis, el estrés de fibra formación, neurite retracción y aumento transitorio de 2 + C [1, 2, 7]. Los efectos de la LPL están mediadas a través de distintas proteínas G junto receptores que son codificadas por un gen familiar. La primera lysophosphatidic ácido (LPA) gen receptor identificado fue la "zona ventricular gen-1 (vzg-1 / LPA 1)", que fue abundantemente expresado en la zona ventricular de la corteza cerebral de embriones [3]. Recientes estudios demostraron que LPA está relacionada con la sobre regulación de la mielina específicas de las proteínas, cambios morfológicos, y la supervivencia de las células de Schwann (SCS) [22, 24]. Especialmente, Weiner y Chun demostrado que LPA 1 fue expresado por los comités permanentes postnatal, y que promueve la LPA SC supervivencia a través de LPA 1 de activación y una vía incluida Gi, PI3K (phosphoinositide-3-kinasa) y Akt [23].

En el sistema nervioso periférico, los comités permanentes juegan un papel importante en la regeneración axonal tras lesión del nervio. Es bien sabido que hay dos tipos de comités permanentes, myelinating células de Schwann (MSC) y células de Schwann terminal (TSCs). TSCs se encuentran en los cruces neuromuscular (NMJs) y el número de TSCs es generalmente 2-6 células individuales en NMJs [15]. A raíz de denervación parcial, los procesos de TSCs extenderse a la vecina NMJ e inducir la regeneración axonal de la vecina NMJ [16 - 18]. Por otra parte, MSC ampliar, migrar y proliferan en el mismo tubo axonal después de lesiones nerviosas [19, 20]. Estas diferencias en las lesiones post-reacción entre el MSC y TSCs puede reflejar la importancia fisiológica de cada tipo de ESO. Sin embargo, el análisis de TSCs es difícil debido a la escasez y la complejidad de la recogida de TSCs. Hemos elaborado previamente un novedoso método de obtención de TSCs a la única célula nivel y encontró un TSC-gen específico, Herp, mediante la aplicación de PCR-diferencial aparecerá el mensaje [13].

Con el fin de dilucidar los caracteres moleculares de TSCs en comparación con el MSC, hemos estudiado la expresión de receptores de LPL única célula RT-PCR y la hibridación in situ.

II. Materiales y Métodos
Animales

Adultos ratas Wistar (9 - 10 semanas de edad) fueron comprados a un criador (SLC, Japón) 4 días antes del tratamiento, y mantenerse en una temperatura y humedad controladas por los animales con una instalación-12:12 h luz : oscuro ciclo. Los estudios fueron aprobados por la Universidad de Kyoto Prefectural de Medicina de Cuidado de Animales institucional y el empleo Comisión y todos los experimentos se llevaron a cabo de plena conformidad con las normas y reglamentos para el uso experimental y cuidado de animales de laboratorio en Kyoto Prefectural University of Medicine.

Preparación de ARN total de músculo esquelético y células de Schwann, y de ADN genómico

Total RNAs de sóleo y el riñón se extrae y se purifica con RNeasy Mini Kit (Qiagen, EE.UU.), con arreglo a las instrucciones del fabricante. Total RNAs terminal de las células Schwann y células de Schwann myelinating se prepararon tal como está descrita anteriormente [13]. En pocas palabras, única terminal de células Schwann se aisló de la siguiente manera. El sóleo fue disecada a partir de los animales después de una anestesia profunda por inyección intraperitoneal de pentobarbital de sodio. El músculo fue recortado en una porción central en el punto de entrada del nervio ciático y la rama se integra en un plan de baja temperatura de fusión en gel de agarosa. Cruz secciones, 500 μ m de espesor, del músculo se prepararon con un microslicer. Las secciones que incluyen la rama del nervio fueron seleccionados para realizar nuevos estudios. NMJs se coloreen con un tinte fluorescente, 4 - (4-diethylaminostyryl) - N-metil-pyridinium yoduro (4-Di-2-ASP, sondas moleculares, EE.UU.). Después de tratamiento enzimático para la disociación de células, las células individuales fueron recogidos con microcapillaries en virtud de un estereomicroscopio epifluorescent (Nikon, Japón) y trasladados en pequeños tubos que contienen el buffer de lisis celular en Strataprep total RNA microprep kit. Myelinating células de Schwann se prepararon de los nervios ciático de ratas Wistar adultos. Los nervios ciático, libre de perineuro y epineurium, fueron incubadas con colagenasa y tripsina para obtener células disociarse. Las células fueron recogidos y trasladados en la lisis de amortiguación mediante la utilización microcapillaries bajo convencional microscopio de contraste de fase. Después de añadir la levadura tRNA (50 ng) de lo anterior lisados celulares, el total de RNA de cada célula fue purificado de acuerdo con el manual de instrucciones en el kit. ADN genómico de los riñones fue purificado con tejido DNeasy kit (Qiagen, EE.UU.), con arreglo a las instrucciones del fabricante.

cDNA síntesis

Total cDNAs de cada tipo de célula única se sintetizan y amplificado utilizando SMART cDNA síntesis kit (Clontech, EE.UU.) tal como está descrita anteriormente [4, 14]. El optimizado número de ciclos térmicos se fijó en 18. En estas condiciones, cada cDNA amplificado fracción total se obtuvo como moderadamente fuerte frotis que van desde 0,2 a 4,0 kb con una dispersión de varias bandas de brillantes. La expresión de genes de Herp (un marcador de célula de Schwann terminal), S-100 β, y GAPDH en cada fracción cDNA fue confirmada por PCR.

Primer capítulo de cDNAs sóleo y el riñón se inverso-transcrito de 5 μ g de DNasa I tratados con total ARN usando al azar y hexamers Superíndice RNasa H II - (Invitrogen, EE.UU.).

Amplificación por PCR de los genes del receptor de LPL familia de los cDNAs y ADN genómico

PCR utilizando la amplificación de cDNAs, el primer capítulo de cDNA, y el ADN genómico como plantillas, se llevó a cabo con ExTaq ADN polimerasa (Takara Bio, Japón).

Por la reacción de PCR, juegos de cebadores correspondientes a cada gen del receptor LPA familia se utilizaron: 5'-CACTAACCAATGGCAGTATTTGTC-3 'y 5'-CTGGCTTAGGCCAAACCACATAA-3' (LPA 1), 5'-AGCCTGCTTGTCTTCCTRCTCAT-3 'y 5'- TAAAGGGTGGAGTCCATCAG-3 '(LPA 2), 5'-TACATGCTACACACACGGGTGTA-3' y 5'-TAGCGATCTCCTCATGCTCGTA-3 '(LPA 3), 5'-GCCTAAGGACTATGCTGCTGTAA-3' y 5'-GAGTGTGACCAAGGACAGTCATA-3 '(S1P 1), 5 '-CGGAGGCACTGACTAATCAGATT-3' y 5'-TCCCAGCACTCAGGACACAGTTA-3 '(S1P 2), 5'-AACCACAACTCCGAGAGATCCAT-3' y 5'-TTGAAGAGGATGGAGCACTCCTT-3 '(S1P 3), 5'-TRCTSAASACSGTGCTGATGAT-3' y 5'- CKGCTGCGGAAGGAGTAGATGA-3 '(R = A / G, K = G / T: S1P 4), 5'-CGTGTCCTGTGCTTCTGCAA-3' y 5'-CTGCAAACTGTTGGAGGAGTCTT-3 '(S1P 5).

Cada uno de los productos PCR fueron fraccionados tamaño-con un 2% de electroforesis en gel de agarosa seguida de visualización con bromuro de etidio. 2-log tamaño de escalera del ADN marcador (BioLab Nueva Inglaterra, EE.UU.) fue utilizado como un marcador de tamaño.

Secuenciación

Productos de PCR fueron clonados en pCRII ADN plásmido TOPO (Invitrogen, EE.UU.). Secuencia de nucleótidos de cada producto se determinó a través de Big Dye terminator ciclo de secuenciación kit (v1.1) (Applied Biosystems, EE.UU.) y PRIZM310 Genéticos Analyzer (Applied Biosystems, EE.UU.). Homología se ejecutó la búsqueda con BLAST 2,0 programa de software para las bases de datos de GenBank, EMBL, DDBJ, y AP.

Hibridación in situ

Los animales fueron profundamente anestesiados con pentobarbital sódico y se transcardially perfundidos con paraformaldehído al 4% en tampón fosfato salino. Soleus músculos fueron disecados y embebidos en una baja temperatura de fusión en gel de agarosa. Secciones longitudinales del músculo, 200 μ m de espesor, se prepararon con un microslicer.

El PCR-amplificación de los fragmentos de cDNA de rata LPA 3 (nt 1661-2111, GenBank NM_023969) fue clonado en pGEM-T Easy ADN plásmido (Promega, EE.UU.). Digoxigenina cRNA marcado con sondas fueron obtenidos por transcripción in vitro utilizando el plásmido como plantilla. Sentido y antisentido-capítulo sondas fueron sintetizados mediante SP6 y T7 RNA polimerasa (Roche Diagnostics, Suiza), respectivamente.

Hibridación in situ se llevó a cabo de acuerdo con todo el montaje hibridación in situ protocolo, tal como se describe en otro lugar [5, 13] utilizando la fosfatasa alcalina marcado anti-DIG anticuerpo (Fab) 2 fragmento (Roche Diagnostics, Suiza) y NBT / BCIP.

III. Resultados

Con el fin de estudiar si cada uno de los miembros de la familia del receptor de LPL se expresa en una celda de tipo de forma específica, hemos analizado el total de cDNAs preparado TSCs, MSC y del músculo esquelético, respectivamente, mediante amplificación por PCR con cada uno de genes específicos de imprimación.

Con este fin, hemos recogido cada tipo de las células de Schwann y se purifica el total de sus RNAs seguido de cDNA primer capítulo de síntesis y amplificación por PCR del total de cDNAs. Como se muestra en la Figura 1 A, se obtuvieron fracciones cDNAs total de cada tipo de células de Schwann. Algunas de las fracciones cDNAs amplificados fueron insuficientes (como T1 en la Fig. 1 A). Tal total cDNAs fracciones no se utilizaran para el siguiente análisis. Entonces, la expresión de tres genes, entre ellos Herp (un marcador de terminal de células Schwann, como se demuestra en [13]], S-100 β (un marcador de células de Schwann) y GAPDH (a la casa de genes) de cada cDNA fracciones se confirmó por PCR (como se muestra en la Fig. 1 B). El total de cDNAs tres fracciones que expresan los genes mencionados anteriormente se utilizaron para el análisis de la expresión de LPL receptor mRNAs.

Se comparó el patrón de expresión de mRNA del receptor de LPL familia de genes entre células de Schwann terminal y myelinating células Schwann. Reacciones de PCR se llevaron a cabo utilizando cada conjunto de los miembros de la familia de genes específicos de los primers y el total de cDNAs preparado como se ha descrito anteriormente. La amplificación de secuencias objetivo de cada gen a excepción de LPA 2 se incluyó en un solo exón de cada gen. Rat ADN genómico, por lo tanto, se utilizó como control positivo de plantilla para cada reacción de PCR. Por LPA 2, sin embargo, el riñón de rata cDNAs se utilizaron como control positivo. Debido a que cada cebador para LPA 2 se encuentran en distintos exones del gen, la condición de amplificación de PCR realizadas para cDNA plantilla no era aplicable a ADN genómico plantilla. Por lo tanto, cDNAs de riñón de rata adulta donde LPA 2 mRNA se sabe que se expresó fue utilizado como control positivo plantilla. Por otra parte, la transcriptasa inversa-reacción omitido producto tal y como se muestra en la Fig. 1 A), se utilizó como control negativo plantilla.

Como se muestra en la Figura 1 C, 3 LPA se expresó solamente en TSCs, mientras que S1P 1 se expresó en TSCs y músculo esquelético, pero no en MSC. Ni LPA 2 ni S1P 5 es detectable en cualquier tipo de células de Schwann. Otros tipos de LPL genes del receptor, incluida la LPA 1, S1P 2, S1P 3, y S1P 4, se expresaron en ambos tipos de células de Schwann. Ninguno de los LPL genes del receptor de la familia mostró MSC-expresión concreta.

Para confirmar si LPA 3 se expresó en forma selectiva TSCs, hemos realizado la hibridación in situ en NMJs de rata adulta soleus. Hibridación in situ se llevó a cabo para la secciones longitudinales de rata adulta sóleo, según un conjunto de montaje hibridación in situ protocolo. Con la sonda antisentido, señales fuertes se detectaron específicamente en la celda órganos situados en la parte superior del motor terminales nerviosas, pero no en las terminales nerviosas, axones, o postsináptica zonas (Fig. 2 B, C). No se detectó señal utilizando como sonda sentido un control negativo (Fig. 2 A).

IV. Discusión

El presente estudio demostró la expresión concreta de LPA 3 en TSCs presentes en NMJs de soleus rata adulta, con una sola célula basada RT-PCR, así como la hibridación in situ. También hemos demostrado mediante RT-PCR que ninguno de los LPL genes del receptor de la familia mostró MSC-expresión concreta.

En el sistema nervioso periférico, hay dos tipos de células de Schwann, TSCs y MSC. Ambos tipos de células de Schwann comparten el mismo linaje de células de origen, es decir, células de la cresta neural, pero se comportan de una manera diferente después de la maduración [8]. MSC se sabe que contribuyen a axonal derivación y orientación en el proceso de regeneración después de lesiones nerviosas [6, 19]. Por otra parte, TSCs parecen desempeñar papeles clave en el mantenimiento de la estructura y función de NMJs, así como en el proceso de reparación [6, 21]. Recientemente, el Hijo y el Hijo y Thompson et al. Demostrado que los procesos de TSCs extenderse a la vecina NMJ siguientes denervación parcial y la regeneración axonal se observó a lo largo de los procesos de TSCs [16, 18]. El modo de brotación en los nervios NMJ es diferente de que en los nodos de Ranvier siguientes lesiones. La regeneración de los brotes que emergen de los nodos de Ranvier siempre ampliar distalmente dentro de la lámina basal de MSC [14]. Por otra parte, los brotes terminales del nervio penetrar en sus propias células Schwann tubos de lámina basal y crecer hacia el vecino NMJ [17]. Estos diferentes modos de brotación del nervio puede reflejar diferentes propiedades de células de Schwann recursos, es decir, TSCs y MSC. Sin embargo, hay pocos estudios comparativos sobre los aspectos fisiológicos de, así como las características patológicas de TSCs y MSC. Anteriormente ideado un método para aislar y recoger TSCs [13] y este método nos ha permitido analizar la expresión génica en TSCs por RT-PCR. En este sentido, hemos aplicado un método similar para aclarar la expresión de LPL genes del receptor de la familia en TSCs y comparación entre la expresión TSCs y MSC.

LPL es un fosfolípido molécula de señalización que ha vías de señalización intercelular y tiene el amplio funciones biológicas, como la proliferación celular, myogenesis, el estrés de fibra formación, neurite retracción y aumento de Ca 2 + [9 - 12]. El receptor LPL familia de proteínas G, junto receptores se compone de dos grupos: los receptores LPA y sphingosine-1-fosfato (S1P) de receptores. Los receptores LPA LPA consisten en 1 (Edg-2/lp A1 / vzg-1/rec1.3), LPA 2 (Edg-4/lp A2) y LPA 3 (Edg-7/lp A3), y los receptores S1P incluir S1P 1 (Edg-1/lp B1), S1P 2 (Edg-5/lp B2 / AGR16/H218), S1P 3 (Edg-3/lp B3), S1P 4 (Edg-6/lp B4), y S1P 5 (Edg-8/lp B5 / nrg-1). Weiner y Chun estudiado la expresión de receptores de LPL en las células Schwann (SC) in vivo e in vitro utilizando un total de ARN del Norte blot, e informó de que LPA 1 se expresó en alto grado por los comités permanentes en vivo e in vitro, mientras que se S1P 1 sólo se expresa en los comités permanentes en vivo. Ni LPA 2 ni S1P 2 es detectable, aunque S1P 3 se expresó en los comités permanentes en vivo e in vitro [23]. Por el contrario, no hemos podido detectar la expresión de S1P 1 en aislados MSC. Esta diferencia puede ser causada por el método de muestreo, porque Weiner y Chun reconocido expresión de S1P 1 in vivo. Teniendo en cuenta el hecho de que el MSC y TSCs se comportan de forma diferente después de lesión del nervio, valdría la pena estudiar los cambios de expresión de cada uno de los miembros de la familia de genes LPL después de lesión del nervio. Estos estudios están actualmente en curso.

En conclusión, se estudió la expresión diferencial de genes del receptor de LPL familia en TSCs y MSC en única base de células o RT-PCR y se encontró que 3 LPA es específicamente expresado en TSCs confirmada por hibridación in situ. Esta expresión diferencial de los receptores de LPL en TSCs y MSC Mayo subyacen en el comportamiento de cada tipo de las células de Schwann después de lesión del nervio.

Este trabajo fue apoyado en parte por una subvención de Investigación Científica (B) (SO) y por una subvención de Jóvenes Científicos (B) (TY) del Ministerio de Educación, Cultura, Deportes , Ciencia y Tecnología de Japón.