Neural Development, 2007; 2: 6-6 (más artículos en esta revista)

Electroporación métodos basados en vivo, todo el montaje y primaria de análisis de la cultura de pez cebra el desarrollo del cerebro

BioMed Central
Michael Hendricks (michaelh@tll.org.sg) [1], Suresh Jesuthasan (suresh@tll.org.sg) [1]
[1] Grupo de Neurobiología del Desarrollo, Temasek Laboratorio de Ciencias de la Vida, Investigación Link, Universidad Nacional de Singapur, 117604, Singapur
[2] Departamento de Ciencias Biológicas, Universidad Nacional de Singapur, Singapur

Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License (http://creativecommons.org/licenses/by/2.0], que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que la obra original es debidamente citados.

Resumen
Fondo

Electroporación es una técnica para la introducción de ácidos nucleicos y otras macromoléculas a las células. En embriones de pollo que ha sido particularmente poderosa técnica para la espacial y temporal de control de la expresión génica en estudios de desarrollo. Electroporación métodos También se ha informado de Xenopus, el pez cebra, y el ratón.

Resultados

Presentamos un nuevo protocolo para el pez cebra cerebro electroporación. Utilizando un sencillo set-up fijo con electrodos espaciados y microinyección equipo, es posible electroporate 50 a 100 embriones en 1 hora sin letalidad y constantemente altos niveles de expresión del transgen en numerosas células. Transfectadas las células en el cerebro de pez cebra son susceptibles de in vivo lapso de tiempo de imágenes. Explantes que contienen las neuronas transfectadas pueden ser cultivadas in vitro para el análisis. Presentamos también un sencillo método enzimático para aislar todo el cerebro fijo de pez cebra para inmunocitoquímica.

Conclusión

Sobre la base de los métodos descritos anteriormente, hemos optimizado varios parámetros para permitir altamente eficiente unilateral o bilateral la transgénesis de un gran número de células en el cerebro de pez cebra. Este método es simple y ofrece consistentemente altos niveles de la transgénesis de un gran número de embriones.

Fondo

Electroporación se ha utilizado con éxito en embriones de pollo para llevar a cabo la función de ganancia (sobreexpresión) y la pérdida de función (dominante negativo, los pequeños ARN de interferencia, morpholino) estudios en diversos tejidos, especialmente la médula espinal [1, 2]. Más recientemente, protocolos similares se han presentado para su uso con Xenopus [3] y pez cebra [4 - 7], y un poco más arduo métodos técnicos pueden utilizarse para la electroporación en el útero de ratones [8, 9]. Todas las técnicas de electroporación se basan en la aplicación de un campo eléctrico a un tejido en presencia de una macromolécula de interés. El campo induce transitoria poros en la membrana plasmática de las células, así como la mayor parte del flujo de moléculas cargado hacia uno de los electrodos (por ejemplo, hacia el cátodo de carga negativa ácidos nucleicos). Este aspecto direccional de electroporación se ha aprovechado de forma unilateral transfect el tubo neural de pollo, Xenopus y pez cebra.

Nos empezaron a experimentar con la electroporación de pez cebra con el fin de examinar el desarrollo de commissural axón proyecciones en el cerebro. Unilaterales electroporación es una técnica ideal, ya que permite visualizar en detalle la línea media y contralateral commissural comportamiento de los axones. En el embrión de pez cebra transparente, es posible tomar lapso de tiempo las películas cono de crecimiento en la migración de células transfectadas. En nuestros estudios hemos intentado utilizar las técnicas de electroporación, pero ellos encontraron suficientes para nuestros propósitos por dos razones. En primer lugar, se examina la axonal proyecciones de un mutante en la que los embriones homocigotos no podía distinguirse de la de tipo salvaje hermanos en el momento de electroporación (1 día después de fertilización (DPF)), por lo tanto, sólo el 25% de éxito electroporations sería de interés . Esto significaba un gran número de embriones que se había electroporated, con la tasa más alta posible de éxito. En segundo lugar, los axones de interés para nosotros su origen en pequeños grupos de células en el lateral forebrain, que requirió un método reproducible que llevar a la transfección de un gran número de células.

Resultados y discusión

Después de experimentar con variaciones en los protocolos existentes para el pez cebra cerebro electroporación [4, 5], hemos obtenido la más coherente con los resultados experimentales set-up se muestra en la Figura 1. Hemos encontrado que el electrodo de parámetros de diseño, método de montaje, tensión, y el uso de la GAL4/UAS sistema (un sistema bipartito expresión sobre la base de la levadura GAL4 factor de transcripción, que impulsa la expresión de los transgenes regulada por la activación de secuencias de aguas arriba, UAS) fueron todos crítica reproducible para la obtención de altos niveles de expresión en términos de número de células, los niveles de transgenes en las células, y la duración de expresión. Pulso generación parámetros no parece ser crítica para el éxito de la electroporación: solo legumbres y los trenes de pulsos a diferentes frecuencias y duraciones dieron resultados similares.

El equipo utilizado (Figura 1a] se encuentra en la mayoría de los laboratorios de biología del desarrollo. La SD9 estimulador Grass es un elemento básico, barato onda cuadrada generador de impulsos que es simple de usar. Los electrodos son de platino iridio bipolar electrodos paralelos construidos a especificaciones personalizadas (ver Materiales y métodos). Embriones electroporated a 20-24 HPF dio resultados más consistentes que los antiguos embriones (no se muestra). Los embriones fueron montadas yema de tal manera que el cerebro área de interés es accesible tanto para los electrodos y microinyección aguja (Figura 1b]. Uno o dos de los electrodos pueden estar en contacto con el embrión del ojo (s). Es fundamental que los embriones ser montado en cada uno de agarosa gotas en lugar de múltiples embriones montado junto a un mayor volumen de agarosa (Figura 1c]. Con un poco de práctica, es posible electroporate hasta 100 embriones en 1 hora sin letalidad. Cuando los embriones no sobreviven al procedimiento, es normalmente debido a un exceso de daños con la microinyección aguja o durante la retirada de la agarosa.

Se comparó el uso de plásmidos con solo dos plásmido GAL4/UAS sistema, que consiste en el HUC neuronal GAL4 promotor de conducción y el aumento de proteína verde fluorescente (EGFP) o un transgén de interés impulsada conjuntamente por elementos UAS aguas arriba de un promotor basal de pescado [10 ]. Tanto a nivel de expresión y el número de células que expresan transgenes detectables en los niveles se incrementaron varias veces cuando los dos componentes del sistema se utilizó, en comparación con EGFP impulsada directamente por citomegalovirus (CMV), HUC, o α-tubulina promotores (no se muestra).

Electroporación del derecho forebrain con Phuc: GAL4/pUAS: EGFP llevado a robusta expresión en el 2 fdd y el etiquetado de muchos contralaterally la proyección de axones (figura 2a]. Expresión es visible bajo epifluorescente en la mayoría de los embriones, tan pronto como 3.5-4 horas después de la electroporación. Si el lugar de la inyección y la posición de electrodos se mantienen constantes a lo largo de un experimento, todos los embriones se muestran similares patrones de expresión. El cuadro 1 muestra los resultados de un experimento típico. La tensión es importante para la alta, los niveles de expresión reproducible con un mínimo de letalidad, con fuertes disminuciones en las tasas de transfección por debajo de 30 V. Baja tensión puede ser útil cuando un menor número de células transfectadas son deseados. El uso de software volumen renderizado, confocal z-pilas pueden montarse en alta resolución, reconstrucciones de las neuronas transfectadas y sus proyecciones (archivo adicional 1]. Para probar si dos transgenes pueden coexpressed en las mismas celdas, coelectroporated tres plásmidos: Phuc: GAL4/pUAS: EGFP / pUAS: mCherry (figura 2b]. Si bien la mayoría de las células transfectadas expresado tanto las proteínas fluorescentes, hay una amplia gama de niveles relativos de expresión, así como las células que expresan niveles detectables de un solo transgen. Por muestreo a partir de dos embriones coelectroporated que estima que aproximadamente el 60% de las células expresan tanto los transgenes en los niveles más altos (véase Materiales y métodos para más detalles).

Hemos observado niveles elevados de muerte celular, comprobada por tinción con naranja de acridina, en electroporated embriones (Figura 2e]. Estas células fueron esparcidos a nivel bilateral, lo que sugiere que la muerte no es un resultado de transfección, pero probablemente un efecto de la aplicación de campo eléctrico. La morfología del cerebro y las proyecciones axón parecía normal en los mayores electroporated embriones (Figuras 2a-c y 4], lo que sugiere que el aumento de muerte celular no causa graves defectos en el desarrollo del cerebro.

Embriones de pez cebra son transparentes, lo que permite en vivo lapso de tiempo la imagen de la etiqueta fluorescente las células y estructuras. Esto ha sido aprovechado para captar la dinámica de commissural axones lipofílicas trazador utilizando tintes [11] y líneas transgénicas [12]. Electroporación permite la extensión de estas técnicas para el análisis de los efectos específicos de los transgenes en la dinámica de crecimiento de cono. Se utilizó la electroporación de Phuc: GAL4/pUAS: EGFP para hacer que el tiempo transcurrido películas de la comisura habenular pez cebra, las formas en que el dorsal DIENCÉFALO en torno al 45-48 HPF (figura 2c; archivo adicional 2]. Expresión de transgenes diferentes nos va a permitir poner a prueba las necesidades de determinadas vías de señalización para el cruce de la línea media.

Nuestro objetivo era experimental para probar los transgenes prevé que afectan a la orientación axón. Con este fin, hicimos una pasarela de vectores de expresión para facilitar la rápida clonación y expresión de genes de interés como carboxi-terminal de proteínas de fusión EGFP bajo el control de la UAS. Hemos probado dominante negativa del receptor de construcciones, donde el dominio citoplásmico de un receptor de interés ha sido reemplazado con EGFP. Hemos construido para los receptores de fusiones canónica axón orientación del receptor de clases entre ellos Ephs, suprimido en pacientes con carcinoma colorrectal (DCC), y Robos. Ryk, un vertebrado homólogo de Drosophila descarrilado, es un receptor Wnt con varias funciones en el axón de orientación, incluyendo la cartografía topográfica de la retina axones [13, 14]. Hemos construido una dominante negativa del receptor de pez cebra Ryk fundido a EGFP (dnRyk: EGFP) y se utiliza para expresar la electroporación en un subconjunto de células ganglionares de la retina (Figura 3a]. El resultado tectal proyecciones (no se muestra) se observa fácilmente en vivo.

Ef El receptor tirosina quinasas constituyen una gran clase de orientación axón receptores. Hemos hecho dominante negativo Ef receptores, incluyendo los EphB3. Expresión de dnEphB3-EGFP en una neurona habenular afectados axonal comportamiento. Habenular neuronas normalmente ventroposteriorly proyecto a través del fascículo retroflexus al núcleo interpeduncular [15 - 17]. Figura 3b muestra una neurona habenular expresar dnEphB3-EGFP, lo que causó anormal proceso de ramificación y la elaboración durante los Epitálamo, incluida en el órgano pineal. En otros casos, se observó axones de morfología normal dentro de la comisura habenular, sin embargo, los axones de esta comisura se derivan de la DIENCÉFALO lateral y no la habenulae [18]. Habenular neuronas que expresan normalmente EGFP proyecto (Figura 3c]. En los casos de dnEphB3-EGFP expresión, observamos pequeños, la etiqueta fluorescente vesículas que, al parecer, se derivan de los axones. No observamos estas vesículas con EGFP o con dnRyk-EGFP, pero hizo ver estructura similar cuando los axones fueron etiquetados con tintes membrana lipofílica como DiI (no se muestra). Curiosamente, EphB vesículas que contienen derivados de cultivos de neuronas del hipocampo han sido reportados recientemente [19]. Seguido por electroporación en vivo de imágenes por lo tanto, proporciona pruebas de que tales vesículas se producen en el embrión y pueden ser derivados de ámbitos específicos de la membrana axonal.

Primaria neuronal cultura se ha utilizado con éxito para explorar mecanismos de orientación axón. Crecimiento cono migración in vitro pueden ser ensayados en la presencia de señales que son siempre exógena. Hemos intentado lipofection mediada por transfección de pez cebra neuronal primaria culturas sin éxito (datos no presentados). La alta tasa de transfección de la electroporación, en este caso realiza bilateralmente, permite la fácil identificación de muchos de transgenes que expresan en las neuronas cultivadas cerebro explantes (Figura 3d, e].

Si bien el dorsal regiones del cerebro son fácilmente visibles en vivo, ventral y lateral de algunas estructuras son oscurecidos por los ojos, mandíbula, y branquias. Eliminar el cerebro seguido de la fijación y la tinción de anticuerpos permite imágenes de alta resolución de todo el cerebro, pero es algo tedioso para un gran número de embriones. Prueba de fijación y diversos protocolos para la permeabilización inmunocitoquímica, serendipitously encontró que un gran número de cerebros puede aislarse fácilmente a partir de embriones de fijación en ácido tricloroacético (TCA), seguido por la digestión colagenasa. Estos cerebros son adecuados para montar toda la tinción de anticuerpos, aunque no todos los antígenos están bien conservados después de TCA y la fijación del tejido morfología es indistinto brillante bajo la óptica sobre el terreno. Etiquetado de montaje fijo todo el cerebro con anti-GFP y anti-tubulina acetilado anticuerpos permite la comparación de las proyecciones axonal de las neuronas transfectadas en relación con la neuroanatomía del cerebro (Figura 4]. Una vista lateral de la parte derecha se muestra la celda transfectadas órganos, principalmente en el telencéfalo y DIENCÉFALO (Figura 4e]. Desde la izquierda, las proyecciones resultantes contralateral pueden ser analizados (Figura 4h].

Algunos problemas técnicos, lo que estamos tratando. Electroporación de embriones mayores de 24 HPF producido resultados inconsistentes y una disminución global del número de células transfectadas. Sin embargo, algunos expresaron que los transgenes parecía perturbar la diferenciación neuronal o la supervivencia celular y queremos expresar más tarde. El uso de choque térmico GAL4 promotores de conducción, ya sea en un plásmido o en un fondo estable transgénicos, por lo que esa expresión puede ser temporalmente controlado es una solución prometedora.

Otra cuestión es que algunos transgenes que hemos probado parece estar regulada post-transcriptionally y espacialmente, y sólo se encontraron en particular, los compartimentos subcelulares, en el marco de distintos puncta, o estaban presentes en niveles bajos. En estos casos, toda la morfología de una neurona transfectadas es difícil de imagen, y el tiempo transcurrido de imágenes fue práctico. Idealmente, nos gustaría coexpress una proteína fluorescente de color rojo para la etiqueta de toda la neurona. Porque coelectroporating UAS dos vectores con la GAL4 conductor condujo a coexpression incompatibles, estamos probando Gateway vectores de expresión que contienen dos elementos independientes UAS: una conducción citosólicas la proteína fluorescente de color rojo mientras que el otro impulsa la construcción de EGFP fusión de intereses.

Conclusión

El método de electroporación permite que aquí se presenta por la simple y eficiente introducción de los transgenes de interés en las poblaciones de neuronas. Los actuales métodos de electroporación de pez cebra neuronas son eficaces, pero tienen importantes tasas de letalidad y que pierda la transgénesis. Cerda y colegas [4] demostró la electroporación de ARNm y morpholinos además de ADN, y pudieron transfect diversos tejidos, incluido el cerebro, retina, somites, y tronco. En nuestras manos, la manipulación independiente de los electrodos y la inserción de un electrodo en el embrión dado lugar a frecuentes letalidad y la dificultad transfecting reproducible en las mismas celdas en múltiples embriones. Por otro lado, el posicionamiento independiente de los electrodos de esta técnica permite una mejor focalización de la intensidad de campo eléctrico en comparación con nuestra relativamente grandes electrodos externos. El protocolo que aquí se presenta tiene la ventaja de la simple colocación de los electrodos y de permitir que un mayor número de embriones destinados a ser transfectadas de manera uniforme. Como se basa en los electrodos de venta en el comercio y equipo básico, debería ser fácilmente reproducible en cualquier laboratorio. Esperamos que sea posible, con ligeras modificaciones, a transfect diferentes tejidos y acusados de entregar morpholinos. También puede ser posible restringir la expresión más precisa a las zonas de controlar el volumen y la posición de inyección de plásmido.

Hemos encontrado los parámetros críticos para el éxito a ser la elección de electrodos, el embrión método de montaje, y el uso de la expresión GAL4/UAS sistema. En estos experimentos, aparte de plásmidos se han utilizado. Cada vez hay más disponibilidad de pez cebra transgénico estable líneas expresando GAL4 en virtud de diversos promotores. El uso de estas líneas permitirá único UAS plásmido electroporación, que debería aumentar la eficiencia.

Además de en vivo y todavía lapso de tiempo de imágenes, presentamos dos maneras el método de electroporación se puede utilizar con más instrumentos analíticos. Neuronal primaria la cultura es un poderoso sistema para el estudio de la biología celular del axón crecimiento y orientación. Electroporación permite que estas técnicas in vitro para ser junto con la transgénesis. Transfectadas y no transfectadas axones de la misma explante se pueden comparar en sus respuestas a factores exógena aplicada. El cerebro enzimática técnica de aislamiento es una forma útil para recoger un gran número de muestras. En este caso, hemos utilizado a la imagen en detalle los resultados de una rutina de la electroporación. También es útil para el análisis de fenotipos mutantes, cribado, o en otras situaciones donde el número de cerebros hace necesaria la disección manual práctico. El pez cebra es un buen modelo establecido para la biología del desarrollo de vertebrados. Los métodos que aquí se presenta se extenderá su utilidad para el estudio del desarrollo embrionario del sistema nervioso.

Materiales y métodos
Equipo

Un Zeiss (Oberkochen, Alemania) disecante alcance se ajustó en lados opuestos con dos Narishige (Tokio, Japón) micromanipulators, uno para manipular los electrodos (a la izquierda) y el otro con la aguja de inyección (a la derecha) (Figura 1]. A Narishige inyector la presión del aire se utiliza para la entrega de ADN. A Grass (West Warwick, Rhode Island, EE.UU.). Telefactor SD9 tensión estimulador estaba conectado a los electrodos para proporcionar pulsos. Custom platino iridio paralelo electrodos bipolares 125 μ m de diámetro y espaciados 500 μ m de separación se utilizaron para la electroporación (catálogo # PB-SA0575, FHC, Bowdoinham, Maine, EE.UU.). Durante la electroporación, los electrodos pueden desarrollar depósitos de secado de agarosa. Entre el largo o durante los experimentos los electrodos se limpian con metanol y un cepillo suave, o utilizando una venta en el comercio de joyas ultrasónico limpio.

Pez cebra

Pez cebra se mantuvieron de acuerdo a procedimientos estándar y de conformidad con el Cuidado de Animales institucional y el empleo directrices del Comité. Electroporación se realizó a 18-24 HPF. Una reducción significativa en la eficiencia de transfección se observó en los embriones de más edad. Algunos embriones se suscitaron en el E3 que contiene 0,003% 1-fenil-2-thiourea para prevenir la síntesis de melanina.

Después de haber sido dechorionated con fórceps, los embriones fueron anestesiados por electroporación Ringer (180 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,8 mM CaCl 2, 5 mM Hepes pH 7.2), tal como se describe por Cerda et al. [4], que contiene 0,016% 3-amino benzoico éster etílico del ácido (MS222; Sigma-Aldrich, St Louis, Missouri, EE.UU.). Grupos de 6-10 embriones se sumergen brevemente a 37 ° C 1% de bajo punto de fusión de agarosa (LMPA; Bio-Rad, Hercules, California, EE.UU.) en la electroporación de Ringer. Los embriones se han retirado de la agarosa con una pipeta de vidrio y se coloca invertida sobre un plato de Petri de plástico tapa en cada uno de gotas de LMPA. Como se enfría la agarosa, se les maneuvered en la orientación deseada usando una aguja de tungsteno. Es esencial que los embriones se persona en gotas, las gotas deben ser lo más pequeño posible, y la orientación coherente a fin de facilitar las inyecciones y la posición del electrodo.

Cada grupo fue inmediatamente después de electroporated orientación a fin de que la agarosa es todavía un tanto suave, lo que facilitó la inserción de los electrodos. Después de la electroporación, los embriones fueron cubiertos con E3 embrión medio. Al final del experimento, todos los embriones fueron cubiertos con E3 para aproximadamente 15-30 minutos para recuperarse de la anestesia. El pelado se LMPA lejos de la cabeza y yema de huevo con una aguja de tungsteno. Los embriones a menudo wriggle libre en esta etapa, o puede ser removido por aspiración suave con una pipeta de vidrio.

Plásmido de ADN

El Phuc: GAL4-VP16 plásmido utilizado para conducir neuronal expresión ha sido descrito [20]. pUAS: EGFP se hizo mediante la sustitución de la CMV promotor de pEGFP-N1 (Invitrogen, Carlsbad, California, EE.UU.) con un promotor compuesto por 14 elementos UAS aguas arriba de un promotor basal de pescado [10], y pUAS: mCherry por consiguiente sustitución de EGFP en este plásmido con mCherry de pRSETB-mCherry [21]. Gateway clonación productos de Invitrogen. El pUAS: rfC.1-EGFP Gateway vector de expresión se hizo para expresar genes de interés para el fundido amino terminal de EGFP. El RfC.1 cassette de la Pasarela Vector Conversion kit se ligated en el SMA I sitio de pUAS: EGFP. Entrada clones se realizaron utilizando pENTR / D-TOPO y pCR8/GW/TOPO clonación usando kits Pfu (Stratagene, San Diego, California, EE.UU. o Taq (Ampliar alta fidelidad, Roche, Basilea, Suiza) polimerasa productos PCR, respectivamente. Gateway recombinación Las reacciones fueron realizadas con LR clonase de acuerdo a las instrucciones del fabricante, pero utilizando una cuarta parte de la reacción recomendó componentes y el volumen. Debido pENTR / D-TOPO y pUAS: RfC.1-EGFP son a la vez resistentes a kanamicina, la entrada clon fue linearized en una único sitio de restricción, ya sea antes o después de la recombinación. Por la electroporación, aproximadamente equimolar cantidades de circular GAL4 y UAS plásmido de ADN se utilizaron para una concentración total de 1-2 mg / ml.

pUAS: dnEphB3-EGFP hizo una ampliación de un segmento del pez cebra ephb3 la secuencia de codificación (GenBank: NM_131097 ) Correspondiente a la extracelular y dominios transmembrana de RT-PCR a partir del 3 de ARN fdd pez cebra (avance cebador, 5'-CACCATGGATTATTCGCTGTTATTATAC-3 '; primer invertir, 5'-CGGATCCTCGTAGGTGAAAG-3'). El producto de PCR fue clonado en un vector de entrada Gateway y confirmada por secuenciación. La entrada clon fue utilizado para LR recombinación en pUAS: RfC.1-EGFP (véase más arriba). pUAS: dnRyk-EGFP (GenBank: XM_678748 ) Se hizo de la misma manera (con interés cebador, 5'-CACCATGTTTCTGCCAGCGCGG-3 '; primer invertir, 5'-AAACACGTAGGCCCCCAAAGC-3').

ADN construcciones fueron preparados utilizando Qiagen (Hilden, Alemania) o midi mini juegos de preparación, seguido por la concentración de cualquiera de acetato de sodio / etanol precipitación o evaporación en una centrífuga de vacío se calienta a la concentración deseada en 10 mM Tris. Estas construcciones y sus secuencias están disponibles bajo petición.

Inyección de ADN y electroporación

Agujas para inyección de vidrio fueron tirados de los capilares (1,0 mm OD, ID 0,78 mm, con filamentos) sobre un Flaming Brown-P97 extractora (Sutter Instruments, Novato, CA, EE.UU.) y de nuevo cargados de solución de ADN. La punta de la aguja fue interrumpida con fórceps, y orientada como en la Figura 1. Los electrodos se coloca primero utilizando la izquierda manipulador, seguida por la inserción de la aguja con microinyección el derecho manipulador. ADN se inyecta en el área de interés utilizando un Narishige M30 presión de aire del inyector. Basta ya de ADN se inyectaron de tal forma que la hinchazón del cerebro se observó ventrículo. Inmediatamente, cinco pulsos de 30 V, de duración cada 1 milisegundo se aplicaron manualmente utilizando un estimulador Grass SD9, dando lugar a la electroporación de la parte del cerebro cerca del cátodo. Inyección / pulsante a menudo se repetirá en otros lugares de inyección o para aumentar la tasa de transfección. Del mismo modo bilateral para la electroporación, la polaridad del estimulador se invirtió y la inyección o pulsante se repitió. Posición de electrodos es la misma para la retina la electroporación, pero el ADN se inyectan directamente en la retina.

Brain explante cultura

En 2 fdd, de forma bilateral electroporated embriones fueron anaesthetized en Ringer solución que contenga MS222 y 1 mg / ml de albúmina de suero bovino (BSA). Sus cerebros fueron eliminadas mediante electrólisis afiladas agujas de tungsteno y cortado en pequeños grupos. Un incendio de pulido microinyección aguja con una amplia apertura agujero se utiliza para transferir los macizos del cerebro a una pequeña gota de medio de cultivo con una pipeta de boca (como el lavado de paso). Los macizos fueron luego transferidos a un poli-lisina de revestimiento antideslizante cubrir plato de fondo (Matek, Ashland, Massachusetts, EE.UU.), que contiene 2 ml de medio de cultivo. Media reactivos fueron de Sigma: L15 que contengan 1% N1 complementar el crecimiento neuronal, 10 mM Hepes, y el 1% GPS (glutamina / penicilina / estreptomicina). Explantes se cultivaron durante 8 horas o la noche a la mañana a 28 ° C.

Brain aislamiento

Embriones a fdd 3 o más se fija en 2% TCA en SAFT (buffer fosfato salino-+ 1% Tritón X-100) durante varias horas a temperatura ambiente o durante la noche a 4 ° C. Después de varios lavados en SAFT, los embriones fueron tratados con 1 mg / ml de colagenasa (Sigma) en PBS de 10-20 minutos en un nutator. Después de 20 minutos o si empezó a desmoronarse, los embriones fueron lavados varias veces con PBST para detener la colagenasa digestión. Posteriormente fueron transferidos a una placa de Petri y suavemente swirled en SAFT. Durante este proceso, los embriones se desmoronaría, dejando a cada uno los ojos y el cerebro intacto. Brains a menudo atribuye a la médula espinal.

La inmunocitoquímica y tinción

Aislado cerebros fueron lavados en solución de bloqueo (5% suero normal de cabra / 2% BSA en SAFT) durante una hora. Primaria de anticuerpos de incubación se realizó en solución de bloqueo a 4 ° C durante la noche en un nutator, seguido de varios lavados en SAFT. Secundaria etiquetado se hizo la noche a 4 ° C o varias horas a temperatura ambiente. Anti-tubulina acetilado (Sigma) y anti-GFP (Torrey Pines, Houston, Texas, EE.UU.) se utilizaron a 1:1000. Alexa488 anti-conejo y Alexa568 anti-anticuerpos secundario del ratón (Invitrogen) se utilizaron a 1:500. Para detectar la muerte celular, los embriones fueron incubadas con 5 μ g / ml naranja de acridina (Sigma) durante 30 minutos, seguido por el lavado en E3 y el examen en virtud de epifluorescente.

Imágenes y análisis

Embriones vivos y todo el montaje se cerebros imagen en un Zeiss LSM510 microscopio confocal utilizando un 40 × 0,8 NA objetivo de inmersión en agua. Cultivadas de explantes y teñidas de naranja de acridina embriones fueron imágenes en un Zeiss Axiovert 200 M utilizando un 40 × contraste de fase objetivo, un SPOT Insight cámara CCD (instrumentos de diagnóstico, Sterling Heights, Michigan, EE.UU.) y MetaMorph software (Molecular Devices, Sunnyvale, California, EE.UU.). Proyección de confocal z-pilas se hizo utilizando el software Zeiss y ImageJ NIH [22]. Tomo la prestación se hizo con Volocity (Improvisación, Coventry, Inglaterra). Las fotografías montadas de peces fueron tomadas con una Canon EOS E400. Peces vivos fueron anestesiados y montado en un 1% LMPA/E3. Para el cerebro, salas de montaje se realizaron en un portaobjetos de vidrio de la colocación de capas de cinta aislante y cortar una pequeña plaza. Un cerebro en PBS se suelta en la cámara y una tapa antideslizante colocada sobre ella. La profundidad de la cámara se determinó que se desplazan por ejemplo la cubierta antideslizante girar el cerebro a la orientación deseada.

Cotransformation tasas (figura 2b] se calcula utilizando NIH ImageJ. Confocal pilas fueron separados por canales independientes y umbrales utilizados para permitir una fácil recuento de células de alta intensidad (con las células contiguas etiqueta encima del umbral en un nivel tal que elimina todos los antecedentes). Colocalización de píxeles por encima de umbral se puntuó como cotransfected celda. Cuatro seleccionados en forma aleatoria, no se superponen planos de chimeneas confocal de dos embriones fueron analizados (142 células en total).

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

Autores de las contribuciones

MH realizado los experimentos. MH y SJ concebido y diseñado de los experimentos, interpreta los resultados, y escribió y aprobó el manuscrito.

Material complementario
1 de ficheros adicionales
Tridimensionales volumen prestación de electroporated neuronas. Un volumen de la prestación de un confocal de una pila de vivir 3 fdd embrión electroporated con Phuc: GAL4/pUAS: EGFP
2 ficheros adicionales
Tiempo transcurrido commissural axones. Tiempo transcurrido serie (7,5 minutos / frame) de confocal z-proyecciones de habenular commissural axones cruzan en un 2,5 fdd embrión unilateralmente electroporated con Phuc: GAL4/pUAS: EGFP
Agradecimientos

Nos gustaría dar las gracias a La Cathleen para obtener sugerencias sobre la electroporación y Ajay Sriram electrodo de asesoramiento. pRSETB-mCherry fue amablemente enviado desde el Laboratorio de Tsien. Esta labor fue apoyada por Temasek Laboratorio de Ciencias de la Vida. El pez cebra imagen utilizada en la figura 1b es de la Red de Información sobre Zebrafish (ZFIN), la Internacional Zebrafish Resource Center, University of Oregon, Eugene, OR 97403-5274, EE.UU. [23].