Malaria Journal, 2007; 6: 33-33 (más artículos en esta revista)

Los aspectos epidemiológicos del ciclo de transmisión de la malaria en una zona de muy baja incidencia en Brasil

BioMed Central
Crispim Cerutti (fil.cris @ terra.com.br) [1], Marcos Boulos (dmip.marcosboulos @ hcnet.usp.br) [2], Arnídio F Coutinho (ambientalmalaria@saude.es.gov.br) [3 ], Maria do Carmo Hatab LD (ambientalmalaria@saude.es.gov.br) [3], Aloísio Falqueto (falqueto@npd.ufes.br) [1], Helder R Rezende (heldericas@hotmail.com) [3] , Ana Maria Duarte RC (amrcd@usp.br) [4], William Collins (wec1@cdc.gov) [5], Rosely S Malafronte (rmalafronte@usp.br) [2]
[1] Departamento de Medicina Social, Centro de Biomédicas, Universidad Federal de Espírito Santo, Av. Marechal Campos, 1 468, Maruípe, Vitória-ES, Código Postal: 29040-091, Brasil
[2] Departamento de enfermedades infecciosas y parasitarias de la Facultad de Medicina de la Universidad de São Paulo, Av. Dr Arnaldo, 455, Cerqueira César, São Paulo-SP, Brasil
[3] Departamento de Salud del Estado, Av. Marechal Mascarenhas de Moraes, 2 025, Bento Ferreira, Vitória-ES, Brasil
[4] Facultad de Salud Pública, Av. Dr Arnaldo, 715 Cerqueira César, São Paulo-SP, Brasil
[5] División de Enfermedades Parasitarias, Centros para el Control y Prevención de Enfermedades, Atlanta, Georgia EE.UU.
[6] Protozoology Laboratorio, São Paulo Instituto de Medicina Tropical, Av. Dr Enéas de Carvalho Aguiar, 470, Cerqueira César, São Paulo-SP, Brasil

Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License (http://creativecommons.org/licenses/by/2.0], que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que la obra original es debidamente citados.

Resumen
Fondo

Extra-amazónica autóctonas Plasmodium vivax infecciones se han reportado en las regiones de montaña, rodeado por el Bosque Atlántico en el estado Espírito Santo, Brasil.

Métodos

Sesenta y cinco pacientes y 1.777 residentes fueron encuestados entre abril 2001 y marzo de 2004. Incluidos los métodos de laboratorio y delgadas gotas gruesas, multiplex-PCR, ensayo de inmunofluorescencia (IFA) contra la p. vivax y Plasmodium malariae crudo de sangre-fase antígenos y inmunoensayo enzimático (ELISA) para anticuerpos contra el P. vivax-complejos (P. vivax y variantes) y P. malariae y Plasmodium brasilianum circumsporozoite-proteína (CSP) antígenos.

Resultados

Promedio de edad fue 35,1 años. La mayoría (78,5%) eran hombres; 64,6% vivía en zonas rurales; 35,4% eran agricultores, y el 12,3% estudiantes. No ha sido relevante la historia de los viajes. Noventa y cinco por ciento de los pacientes experimentan su primer episodio de malaria. Laboratorio de datos de 51 pacientes fueron consistentes con p. vivax infección, que fue determinado por delgadas de Papanicolau. De estas muestras, 48 se analizaron por PCR múltiplex-. Cuarenta y cinco fueron positivas para P. vivax, lo que confirma los resultados parasitológicos, mientras que P. malariae se detectó en una muestra y dos dieron resultados negativos. El cincuenta por ciento de los 50 pacientes habían probado anticuerpos IgG contra la p. vivax-complejo o P. malariae CSP mediante ELISA. Los porcentajes de residentes con IgM e IgG anticuerpos detectados por IFA para p. malariae, P. vivax y Plasmodium falciparum que no se quejan de síntomas de la malaria en el momento de sangre se recogieron fueron 30,1% y 56,5%, 6,2% y 37,7%, y el 13,5% y 13%, respectivamente. Lo mismo que los sueros reaccionaron a P. vivax también reaccionó a P. malariae. Los siguientes números de las muestras fueron positivas a multiplex-PCR: 23 para p. vivax; p. 15 para malariae, 9 para p. falciparum y sólo uno de p. falciparum y P. malariae. Todos los finos y gotas gruesas fueron negativos. ELISA antígenos contra la CSP fue positiva en 25,4%, 6,3%, 10,7% y 15,1% de las muestras analizadas para la "clásica" P. vivax (VK210), VK247, P. - vivax y P. como malariae, respectivamente. Anofelinos captura en la zona de transmisión reveló sólo zoophilic y exophilic especies.

Conclusión

La baja incidencia de casos de malaria, el hallazgo de habitantes asintomáticos y la separación geográfica de los pacientes aliado a serológicas y moleculares resultados plantean la posibilidad de la existencia de un reservorio símico en estas áreas.

Fondo

Hay 300 a 500 millones de nuevos casos de malaria en todo el mundo cada año, y en consecuencia estos 0,7 a 2,7 millones de muertos [1]. Casi todos los casos de malaria en Brasil se informó de la región amazónica, con 459013 casos en 2004 [2]. Fuera de la región amazónica, la malaria se limita a focos residuales en las zonas donde los restos de bosques tropicales, pueden encontrarse aún. Uno de ellos es el estado de Espírito Santo.

Espírito Santo es un estado costero situado en el sureste de Brasil. Indígenas se observa la malaria en las tierras altas, que no son más de cincuenta kilómetros por término medio del mar. De diez a treinta casos autóctonos son reportados cada año en una superficie de unos 5343 km 2. Las especies diagnóstico, sobre la base de gota gruesa examen, se reporta como la malaria vivax con una baja del parásito se cuentan como una norma (menos de 300 parásitos / mm 3 de sangre). No hay ningún caso las agrupaciones a excepción de una pocas ocasiones en que dos casos fueron registrados en el mismo lugar al mismo tiempo. Como la transmisión no puede ser explicado por el hombre-a-hombre en la dispersión de esa situación, se decidió proceder a una investigación para aclarar la posibilidad de que haya un reservorio no reconocido y para determinar con mayor precisión la especie de que se trate. Además, las muestras de plasma de pacientes infectados y los residentes fueron seleccionados con el objetivo de identificar los anticuerpos contra el Plasmodium vivax-complejos (P. vivax y variantes) y Plasmodium malariae y Plasmodium brasilianum circumsporozoite proteína (CSP).

Métodos
Área de estudio y población

Indígenas casos de malaria en el estado de Espírito Santo se registran principalmente en nueve municipios distribuidos en un óvalo en forma de área de aproximadamente 5, 343 km 2 con una población de 215000 habitantes. Estos municipios se encuentran entre 19,6 ° y 20,6 ° de latitud sur y 40,6 ° y 41 ° Longitud Oeste (Figura 1]. La topografía es irregular, con estrechos valles y pequeñas montañas con una altura media de alrededor de 800 metros. El clima es tropical, pero temperaturas más bajas de alrededor de 15 ° C se producen durante los meses de invierno (de mayo a agosto) debido a la gran altura. La economía se basa en la agricultura, con el café, bananas y hortalizas se cultivan en pequeñas explotaciones. El bosque tropical en las cimas de las colinas es todavía bastante conservado y está muy cerca de las viviendas. La fauna está constituida por aves, reptiles y pequeños mamíferos, entre ellos simians de la Cebidae Atelidae y familias. A pesar de anofelinos del subgénero Nyssorhynchus se encontraron en estas áreas, Anopheles darlingi, que es incriminado en la transmisión de la malaria en la cuenca amazónica, está ausente en esta región. Sin embargo, Anopheles (Kerteszia) cruzii, una especie acrodendrophilic responsable de la transmisión de la malaria en el Bosque Atlántico, que está fuera de la región amazónica, se puede encontrar en el bosque, pero no cerca de las casas. La población está compuesta principalmente por descendientes de siglo XIX el alemán y el italiano inmigrantes.

Diseño del estudio

Una vez que un nuevo caso ha sido detectado y después por escrito el consentimiento informado había sido firmado, un cuestionario fue rellenado con demográfica, ocupacional y datos sobre el medio ambiente. Cinco ml de sangre venosa se señala en un tubo de vacío con EDTA de gruesos y delgados de Papanicolau preparativos, serología y PCR procedimientos. La sangre fue centrifugada a 300 g para separar los glóbulos rojos del plasma y se mantiene a -20 ° C hasta que fue transportado en hielo seco por vía aérea a la Protozoology en el Laboratorio de São Paulo Instituto de Medicina Tropical para su procesamiento. Después de la matrícula, el paciente fue tratado de inmediato con arreglo al Ministerio de Salud de Brasil normas para el tratamiento del paludismo. Para el 14 º al 50 º de pacientes inscritos en el estudio, cada sujeto tenía su domicilio visitados por el equipo de investigación, que también visitó el tema a los vecinos de un área de aproximadamente dos kilómetros en torno a la casa del paciente. Procesamiento de vecinos' muestras de sangre era el mismo que el descrito para los pacientes.

Para efectos del control serológico, después de escrito el consentimiento informado se firmaron las formas, más 192 muestras de sangre fueron recolectadas en una malaria sin zona situada a 50 km al sur del extremo sur del paciente vivienda.

Gruesos y finos de preparación de Papanicolau y de la lectura

Gruesos y finos se prepararon frotis de acuerdo a la técnica recomendada por la Organización Mundial de la Salud [3]. Las diapositivas se lee mediante un microscopio de luz a 1000 × magnificación.

CSP ELISA

Anti-CSP anticuerpos fueron detectados utilizando péptidos sintéticos correspondientes a la p. vivax-complejos (P. vivax y variantes) y P. malariae circumsporozoite proteína (CSP) en la literatura [4 - 7].

La técnica se realizó de acuerdo a Zavala et al. [8] y Curado et al. [9]. Cut-off valores fueron tomados como tres desviaciones estándar por encima de los medios de las absorbencias obtenidas de las pruebas 40 muestras de suero de donantes de sangre que nunca había vivido en la transmisión de la malaria. Los siguientes valores de línea de corte se utilizaron: 0,178 para el "clásico" P. vivax, P. de 0,297 vivax VK247, 0,292 para p. vivax y-al igual que para 0,153 p. malariae.

De ensayo por inmunofluorescencia (IFA)

Ferreira y Sánchez del protocolo [10], fue seguido con ligeras modificaciones. Crudo de sangre-fase antígenos se obtuvieron a partir de p. vivax pacientes infectados, P. malariae-monos infectados y P. falciparum culturas. Cut-off 1:80 valores fueron para la detección de IgM e IgG y anticuerpos correspondió a la mayor dilución que muestra fluorescencia de células sanguíneas en un panel de 40 muestras de suero de donantes de sangre que nunca había vivido en la transmisión de la malaria. Debido a la dificultad en la obtención de parásitos en sangre de pacientes con malaria malariae (P. malariae es a veces difícil de distinguir de P. vivax en una gota gruesa), una serie de diapositivas de p. malariae parásitos fueron amablemente proporcionados por el CDC / Atlanta. Sólo aquellos pacientes que dieron resultados positivos en ELISA contra p. malariae CSP se realizaron pruebas de anticuerpos contra esta especie de IFA. Los resultados se expresaron como títulos correspondientes a la reciprocidad de la última dilución del plasma que dieron una reacción positiva.

Multiplex PCR

Después de la descongelación, de color rojo-sangre "pellets" de células fueron sometidas a extracción de ADN de acuerdo a las instrucciones provistas con el asistente ® ADN genómico (Promega) kit comercial con las siguientes modificaciones de menor importancia: tras la adición de 1 μ l 5% de saponina, la sangre se incubaron a 37 ° C durante cinco minutos después de la incubación y el precipitado se lava con PBS hasta que se convirtió en el sobrenadante claro. Todas las demás medidas se llevarán a cabo de acuerdo a las instrucciones suministradas con el kit. Para la amplificación, el Rubio et al. [11] protocolo fue seguido. La reacción se llevó a cabo en dos fases para mejorar la sensibilidad. Especies de primers específicos fueron utilizados para detectar las tres especies responsables de la infección por malaria en Brasil, a saber, P. vivax, P. y P. malariae falciparum. Plasmodial AND extraída de la p. pacientes con malaria vivax que asisten a la Superintendencia para el control de endemismos (SUCEN) en São Paulo o de p. falciparum culturas, se utilizaron como controles positivos.

Anofelinos captura

La entomología equipo visitó cada uno de los lugares de transmisión de no más de siete días después de que el procedimiento de muestreo de sangre. Los mosquitos fueron capturados al azar entre las 6:00 pm y 10:00 pm, tanto en interiores y al aire libre. El Castro aparato fue utilizado para recoger los mosquitos, y los especímenes fueron identificados en la Unidad de Medicina Tropical, Universidad Federal de Espírito Santo, basado en el método de Faran y Linthicum [12]. Tras la identificación, las muestras fueron almacenadas en tubos Nunc lleno de alcohol isopropílico, con cada una de ellas contiene sólo los mosquitos de la misma especie y ubicación. Los tubos fueron enviados al Laboratorio Protozoology en São Paulo el Instituto de Medicina Tropical de la prueba para detectar la presencia de Plasmodium por PCR.

PCR procedimiento utilizado con las muestras de mosquitos

ADN de cada grupo de un máximo de diez ejemplares de la misma especie y el lugar se extrajeron de acuerdo con el protocolo Oskam [14], con las siguientes modificaciones menores: después de una incubación a 60 ° C durante tres horas en lyses de amortiguación, las muestras fueron centrifugadas a 10000 g durante 10 minutos. El sobrenadante fue cosechada la noche a la mañana y mantenerse a -20 ° C después de la adición de 0,1 volumen de acetato de sodio y dos volúmenes de enfriado del 100% de etanol. El material fue luego se centrifuga de nuevo a 10000 g a 4 ° C durante 10 minutos. El sedimento fue lavado con etanol 70% y resuspendido en 50 μ l de TE después del secado. Para la amplificación, el protocolo Kimura [13], modificada por Win et al. [15] fue seguido. Especies de primers específicos se utilizaron para detectar p. vivax, P. y P. malariae falciparum.

El análisis de los datos

Las variables continuas se expresaron como medios o medianas en términos de su adecuación a la normalidad. Variables categóricas se expresaron como porcentajes. Serológicos resultados se expresaron como media geométrica de los títulos o absorbancia en función del ensayo. De correlación de Spearman test (dos colas) se aplicó para verificar la presencia de correlación entre ELISA o IFA absorbencias títulos y la edad. La misma prueba se aplicó para determinar si existe una correlación entre el ELISA y absorbencias tanto IgM e IgG IFA títulos. El Kruskal-Wallis test no paramétrico se aplicó para determinar si existe una asociación entre absorbencias ELISA o IFA títulos (IgM e IgG) y la de los pacientes en las variables de ocupación, actividades profesionales relacionadas con el medio rural y el nivel de contacto con el medio rural. Las diferencias entre las proporciones se evaluaron con la prueba de ji al cuadrado o la prueba exacta de Fisher, como se indica. Un 5% de nivel de significación fue utilizado.

Éticos de limpieza

El estudio fue aprobado por los Comités de Ética Biomédica del Centro, Universidad Federal de Espírito Santo y São Paulo el Instituto de Medicina Tropical.

Resultados
Los datos epidemiológicos

A partir de abril de 2001 a marzo de 2004, sesenta y cinco pacientes se inscribieron en el estudio. Doce estaban matriculados en 2001, 18 en 2002, 24 en 2003 y 11 en 2004 (hasta finales de marzo) (Tabla 1]. Los casos se produjeron a lo largo del año, con un pequeño predominio en marzo y abril. Los porcentajes de casos en 2001 y 2004 fueron bajo vigilancia porque no era durante todo el año en esos años. Seis casos ocurrieron en 2001 antes de abril, y 20 en 2004 después de marzo (el pasado mes de vigilancia).

La edad media de pacientes fue de 35,1 años. La mayoría de los pacientes fueron del sexo masculino (78,5%) y 2 / 3 de ellos viven en zonas rurales (64,6%). Los que vivían cerca de las ciudades o en la capital, declaró al menos una visita a una zona rural en los últimos 30 días. Las ocupaciones más comunes fueron declarados los agricultores (35,1%) y estudiantes (14%), pero la mayoría de los estudiantes ayudar a sus familias en la tierra, tanto durante la siembra y la cosecha, aumentando así la cifra de profesionales en contacto con las zonas rurales a 59,6%. Con independencia de la ocupación, algún tipo de contacto frecuente con la tierra fue declarado por el 67,3% de los pacientes. Muchos de ellos viven y trabajan en las ciudades, pero tenía una casa en una zona rural que visitó casi todos los días.

Casi 1 / 3 de los pacientes (30,8%) no había viajado en los dos años anteriores. Los que habían viajado alegaron no han viajado a la región amazónica. Un tercio de los pacientes (33,8%) habían estado viviendo en el área de transmisión, ya que han nacido. Casi todos los pacientes (95%) experimentan su primer episodio de malaria. Sólo el 36,9% de los pacientes declara haber visitado el bosque, pero este bajo porcentaje puede representar un sesgo de información como la población local es muy miedo de las leyes ambientales. El bosque, sin embargo, está cerca de las viviendas, por lo que la exposición es posible independientemente de si hay o no en excursiones. El cuadro 2 muestra la relación entre el recorrido la historia y la historia de las visitas al bosque.

Algún tipo de contacto entre los pacientes o entre los pacientes y otros casos de malaria antes de la enfermedad se encontró en 11 casos. Los pacientes 2 y 3 se casaron entre sí y los primeros síntomas en casi el mismo tiempo. Los pacientes 28 y 29 se relacionan y se declaró un caso de malaria que han tenido lugar cinco meses antes, a 1 km de su casa. 30 paciente fue informado de un caso de malaria el mes anterior a 15 km de su casa. Paciente 32 han estado en contacto con dos casos de malaria cerca de su casa hace dos años. 35 Paciente declarado contacto frecuente con 28 casos y 29 y se convirtió en los malos, tres meses después de ellos. Los pacientes 40 y 41, que eran de la misma región geográfica, se convirtió en los malos al mismo tiempo. Los pacientes 42, 44 y 45 se convirtieron en los malos entre junio 9 y 18 de julio de 2003. Ellos vivían cerca de una de la otra. Caso 51 también vivió cerca de ellos, pero sólo enfermó en noviembre del mismo año. Caso 53 informaron contacto con un paciente de malaria que habían llegado de la región amazónica 30 días antes. Casos 52 y 59 estaban relacionados pero vivía a unos 100 km de distancia y se convirtió en los malos dentro de un intervalo de dos meses. Los pacientes 55 y 56 eran casados entre sí y se convirtieron en los malos al mismo tiempo.

A partir de marzo de 2002 y noviembre de 2003, 1777 los residentes de las localidades afectadas se presentaron para la toma de muestras de sangre, con una mediana de 46 muestras recogidas para cada caso. La edad media de los residentes era 31,3 años. La distribución por género fue equivalente (52,3% hombres; 47,7% mujeres). Setenta y cinco por ciento de los residentes (1333 sujetos) han nacido en los mismos municipios donde los casos se habían producido. Del resto, 290 (16,3%) habían nacido en otros municipios en el estado y 144 (8,1%) en otros estados o países. La información no se obtuvo durante diez residentes (0,6%). Sólo dos temas nacieron en la región amazónica. La mediana del tiempo de residencia en la zona afectada es de 16 años. Los viajes en los dos años anteriores fue declarado por 1143 habitantes (64,3%), pero sólo doce de ellos (0,7%) declararon que habían viajado a la región amazónica.

Los datos clínicos

Los síntomas de los pacientes eran abundantes y de larga duración, pero no grave. El intervalo entre el primer síntoma y el diagnóstico fue de 13,9 ± 7 días. La fiebre estaba presente en todos los pacientes. Se periódico en 96,9% de los casos, se producen cada 48 horas en el 73,8% de los casos y cada 24 horas en el resto. Bazo era palpable en sólo el 57,4% de los pacientes, la medición de 2,7 ± 0,7 cm por debajo del margen costal izquierdo.

Los pacientes se quejaron de varios síntomas. Otros signos y síntomas tales como dolor de cabeza (87,7%), escalofríos (86,2%), sudoración (75,4%) y debilidad (72,3%) fueron denunciados.

Gruesos y delgados de Papanicolau lecturas

Parásitos de la malaria se encontraron en las diapositivas preparadas con sangre de los pacientes pero no en los que se preparen con la sangre de otras personas a prueba. Parásitos morfología es compatible con p. vivax, con la ampliación de los glóbulos rojos, típico punteado y ampliada amoeboid citoplasma de los parásitos.

Parásitos contar fue baja en la mayoría de los pacientes (83,1%). Con una cifra entre 300 y 500 parásitos / mm 3 se observó en el 7,7% de los pacientes, y el mismo porcentaje tenía una cifra entre 500 y 10000 parásitos / mm 3. Un paciente tuvo un parásito contar de 15000 parásitos / mm 3. Él se había sometido a esplenectomía para el tratamiento de la esquistosomiasis hepatoesplénico varios años antes.

CSP ELISA

De 50 pacientes la prueba de anticuerpos contra los péptidos CSP, 25 (50%) reaccionaron a al menos un péptido sintético. Varios de los pacientes fueron positivos para más de un péptido; el 44%, 22%, 20% y el 22% fueron positivas para la "clásica" P. vivax (VK210), P. VK247 vivax, P. - vivax y P. como malariae, respectivamente.

De 1702 muestras (95,8% del total) recogidos de los residentes y probado, 615 (36,1%) reaccionaron a al menos un péptido sintético. Varios asintomáticos residentes fueron positivas para más de un péptido; 25,4%, 6,3%, 10,7% y 15,1% fueron positivas para la "clásica" P. vivax (VK210), P. VK247 vivax, P. - vivax y P. como malariae, respectivamente. El cuarenta por ciento de las muestras reaccionaron para ambos variante VK 247 y p. malariae CSP péptidos. Cincuenta y un muestras (3%) fueron positivas exclusivamente para p. vivax-like.

IFA

Once pacientes fueron positivos para P. malariae anti-CSP anticuerpos, pero como este antígeno no estaba disponible en cantidad suficiente, sólo siete de ellos se analizaron para la detección de anti-anticuerpos en sangre fase de IFA. Siete pacientes fueron positivos para IgM e IgG con una media geométrica del título (GMT) de 3120 y 390, respectivamente. GMT tanto para IgM y anticuerpos IgG contra p. vivax en los 50 pacientes fueron 1457 y 5761, respectivamente.

Doscientos cincuenta y tres muestras de los residentes se analizaron para la detección de anti-fase de sangre de anticuerpos contra p. malariae de IFA. De estas muestras, 239 fueron seleccionados porque habían reaccionado contra la CSP péptidos sintéticos en ELISA, y 14 habían resultados negativos en contra de p. malariae CSP. De este subgrupo, 72 muestras (30,1%) fueron positivos para los anticuerpos IgM (GMT = 191,1) y 135 (56,5%) positivos para anticuerpos IgG (GMT = 504,7). Los anticuerpos contra la p. vivax crudo sangre fase se analizaron los antígenos de IFA 1701 en muestras de los residentes (95,8% del total). De ellos, 105 (6,2%) fueron positivos para los anticuerpos IgM (GMT = 206) y 641 (37,7%) positivos para anticuerpos IgG (GMT = 313,3). Como diez muestras fueron positivas para P. falciparum de ADN-PCR multiplex (véase más adelante), las muestras al azar y un subconjunto de los negativos (182, o 10,2% del total) se realizarán las pruebas de anticuerpos contra P. falciparum sangre fase de IFA antígenos. Anticuerpos IgM fueron detectados en cuatro de las muestras que fueron positivos por PCR múltiplex-y en 26 de los 182 elegidos al azar (13,5%). Las cifras de anticuerpos IgG eran tres y 25 muestras (13%), respectivamente. GMT fue 101,8 y 116,8 para IgM y anticuerpos IgG, respectivamente. Los porcentajes de resultados positivos de IFA para p. vivax y P. malariae en los distintos municipios en el área de transmisión se muestran en la Figura 2.

Relación con otros títulos de IFA, ELISA absorbencias y las variables demográficas

Una correlación negativa significativa se encontró entre los pacientes entre los anti-p. vivax IFA IgM títulos y la edad (p = 0,042) utilizando el test de Spearman. Todos los demás correlaciones no fueron estadísticamente significativas al 5%. No existió asociación se encontró en función de la de Kruskal-Wallis test no paramétrico entre anti-p. vivax IFA títulos (IgM e IgG) o ELISA absorbencias y las variables de ocupación, actividades profesionales relacionadas con el medio rural o el nivel de contacto con el medio rural.

Una mayor frecuencia de las muestras que fueron IgG positivos de IFA se encontró entre los varones residentes. La frecuencia encontrada para p. malariae fue de 52% para los hombres y 37,5% para las mujeres (p = 0.03); las cifras correspondientes a p. vivax fueron 40% y 35% (p = 0,03). Una parte significativa correlación positiva se encontró entre el momento para que el sujeto había vivido en el área endémica y anticuerpos IgG contra p. vivax de IFA utilizando el test de Spearman (p = 0,05). Ninguna de las otras correlaciones alcanzado el nivel de significación. Aunque hubo más resultados positivos contra la "clásica" P. vivax (28% vs 23%) (p = 0,02) y VK 247 (8,1% vs 4,7%) (p = 0,005) entre las mujeres, este no es el caso de cualquiera de los otros péptidos sintéticos.

Multiplex PCR

Multiplex PCR se utilizó para las muestras de 48 pacientes. P. vivax fragmentos correspondientes a 499 pb se ampliaron en 45 pacientes "muestras (93,8%), proporcionando pruebas de p. vivax infección, mientras que un 269-bp fragmento correspondiente a P. malariae infección se detectó en una muestra del paciente (2,1%). No se observó amplificación para dos pacientes (4,2%). Algunos de estos resultados se muestran en la Figura 3.

Esta técnica también se utilizó para las muestras de 1527 residentes (85,9% del total). P. vivax fue amplificado en 23 muestras (1,5%), P. malariae en 15 (0,9%) y un fragmento de 395 pb compatible con p. falciparum en 9 (0,5%). Mezcla de infección (P. malariae y P. falciparum) se detectó en una muestra (Figura 4]. Todos los residentes que fueron positivos por PCR multiplex-estaban asintomáticos al momento de la toma de muestras, y no los parásitos fueron identificados por una u otra gruesa o delgada frotis de sangre. Aunque este estudio se está llevando a cabo, estos temas no se desarrolló signos o síntomas.

IFA para la detección de anti-anticuerpos en sangre fase de los residentes de la no-área endémica

Ciento noventa y dos residentes de la falta de área endémica siempre muestras de sangre para pruebas de IFA. La mediana de edad de estos sujetos fue de 16 años y la mayoría eran mujeres (56,3%). La mediana del tiempo para que los pacientes habían vivido en la localidad fue de 13 años. Alrededor de la mitad de ellos (104/192) (54,7%) habían nacido en la misma zona que vivían en, y ninguno había nacido en zonas palúdicas. Viajes fuera de la región amazónica en los últimos dos años fue declarada por 138 sujetos (71,9%). IFA para la lucha contra la sangre de anticuerpos etapa fue negativo para todos ellos.

Random captura de mosquitos

En el curso del estudio, 785 anofelinos especímenes fueron capturados en los distintos lugares donde la malaria es endémica. Las especies identificadas se muestran en la Tabla 3. Uno de 100 bp fragmentos p. compatible con vivax fue amplificado en una muestra que contiene siete especímenes de An. (N.) evansae.

Discusión

Esta encuesta transversal investigado 65 pacientes de un total de 70 casos registrados en un período de tres años en una zona de muy baja incidencia de la malaria. Los resultados revelaron un predominio absoluto de todas las infecciones por el CSP variantes de P. vivax. No hubo caso, la agrupación que podría sugerir la transmisión entre los pacientes, a excepción posiblemente de los pacientes 42, 44 y 45. Como los casos se produjeron muy lejos unos de otros, la posibilidad de un simple hombre-vector-hombre ciclo de transmisión debe ser cuestionada. La mayoría de los pacientes fueron del sexo masculino, dispersas y captura de mosquitos en el área que rodea sus casas anofelinos especies identificadas con un limitado potencial de transmisión, tales como An. evansae, An. lutzi y An. strodei, todo lo cual se considera que han limitado anthropophilic comportamiento [16 - 18]. En conjunto, estos datos sugieren fuertemente la transmisión al aire libre como la mayor parte del trabajo en la tierra, donde la probabilidad de exposición es mayor, se lleva a cabo por los hombres, y no hay vectores que podrían causar la transmisión dentro de las casas.

Dos posibles explicaciones para la transmisión de tal ajuste puede ser considerado. La primera es que los casos descubiertos son sólo la punta de un mayor número de infecciones humanas que se manifiestan ya sea como auto-limitado o siguen siendo las enfermedades asintomáticas. De hecho, una encuesta de población llevado a cabo simultáneamente en la zona reveló una importante prevalencia de anticuerpos contra la sangre-fase formas y un pequeño número de personas asintomáticas con resultados positivos de PCR. Una parte significativa correlación positiva se encontró entre la longitud de tiempo durante el que los sujetos habían estado viviendo en el área endémica y anticuerpos IgG contra p. vivax en la prueba de IFA, pero no entre las mismas variables demográficas y otras IFA resultados de la prueba. Los mismos resultados de p. vivax anticuerpos fueron descritas por Curado et al. [9] en otras áreas cubiertas por el Bosque Atlántico. La discrepancia observada en otras pruebas de IFA podría explicarse por el menor tamaño de la muestra de los temas a prueba de lucha contra la p. malariae y P. anti - falciparum anticuerpos. Sin embargo, no está claro por qué hay tan pocas personas sintomáticas si unos cuarenta por ciento de los residentes sujetos tienen pruebas de infección anterior de acuerdo con los resultados de IFA. Aunque se puede argumentar que el IFA prueba no es muy específica, los estudios anteriores [10, 19] puso de manifiesto una aceptable especificidad de la prueba de IFA, que se ha utilizado en varias encuestas serológicas en áreas endémicas [20 - 23]. Además, ninguna de las muestras de los residentes de la falta de área endémica de este estudio dieron falsos positivos resultados. Es poco probable que las personas sintomáticas podrían no se detectan ya que existe una rígida vigilancia de casos de malaria en la zona afectada, y el gobierno-siempre y servicios son la única fuente de tratamiento específico. Si bien es posible que las personas sintomáticas podrían ir inadvertido si su enfermedad es autolimitada, es poco probable en una zona de baja incidencia en vista de la ausencia de una historia previa de la malaria en la mayoría de los pacientes. Como los anofelinos capturados al azar en las cercanías de las casas han limitado anthropophilic comportamiento, la cuestión también se plantea en cuanto a que son los vectores que son tan competentes en el mantenimiento de tan amplia asintomáticos depósito con tan pocos parásitos circulantes.

La segunda posible explicación es que hay un no-humanos reservorio de parásitos en este ámbito, símico la malaria es la más fuerte posibilidad. Simian malaria en Brasil es causada por dos especies de plasmodios, es decir, p. y P. brasilianum simium [24 - 31]. P. brasilianum se encuentra tanto en el interior de la región amazónica y en el Sur y Sureste del país [25 - 32] mientras que P. simium tiene una distribución más restringida limitada por los 20 ° de latitud sur y 30 ° de latitud Sur y sólo se encuentra en el Sur y Sureste del país [25, 30]. El vector responsable de la transmisión de ambas especies fuera de la región amazónica es Anopheles (K.) cruzii, el mismo vector que se encarga de la transmisión de la malaria humana antes de las campañas que erradicó la malaria fuera de la cuenca amazónica [24 - 31].

Plasmodium brasilianum se considera la misma especie humana como p. malariae, debido a las similitudes moleculares [33, 34]. Del mismo modo, P. simium ha sido identificado como el Viejo Mundo-subtipo de p. vivax que circulan en monos del Nuevo Mundo [35]. La misma parásitos, transmitidas por el mismo vector y que circulan en dos diferentes especies huésped en la misma región, interspecies hacer posible la transmisión, por lo menos de vez en cuando. Las encuestas llevadas a cabo por Fandeur et al. [34] en los seres humanos y simians, en la Guayana Francesa sugieren esa posibilidad, que quedó claramente demostrado en otro contexto con otra especie, es decir, p. knowlesi [36]. Basándose en estos informes, la sangre de cinco pacientes fue ensayada por técnicas de PCR defendida por Li et al. [35]. Las conclusiones preliminares con respecto a este autóctonos de malaria mostraron que P. vivax variantes correspondientes a Antiguo y el Nuevo Mundo sympatrically especies existentes en estas áreas.

Una posible explicación es que los hombres en el estado de Espírito Santo son a veces mordido por los mosquitos sporozoites el desempeño de los parásitos presentes originalmente en símico anfitriones. Las pruebas para este fortuito exposición puede ser visto fácilmente si se tiene en cuenta que ninguna relación se podría establecer entre los pacientes títulos serológicos y la exposición medioambiental, lo que sugiere que la infección se produce casi por casualidad. Aunque P. vivax títulos IgM mide por IFA fueron mayores en individuos jóvenes, IgM-positivas se encontraron en todos los grupos de edad (sólo un paciente se IgM negativos), lo que sugiere que, una vez más, el carácter fortuito de este proceso infeccioso como el primer infecciones ocurrieron a diferentes edades. En este contexto, bajo el parásito cuenta podría ser considerada como el resultado de infecciones humanas por los parásitos que no están adaptados a los seres humanos. El alto porcentaje de individuos seropositivos en la población, así como el reducido número de PCR-positivos asintomáticos temas, podrían representar infecciones que ocurren en menos de las personas expuestas presentado a menos infeccioso mordeduras y, en consecuencia, más pequeños inóculos. Los pequeños inóculos producidos por no adaptarse parásitos tendría como resultado el fracaso de estos mismos parásitos a multiplicar lo suficiente como para causar enfermedad, por lo que las infecciones asintomáticas.

Uno puede argumentar que la posibilidad de transmisión es insuficiente. De hecho, la mayoría de los pacientes les niega el contacto con el bosque. However, when we submitted the location of every case to the Global Positioning System (GPS) and crossed the data with the distribution of the forested areas, there was a perfect match, supporting the assumption that either there was information bias regarding the contact with the forests or the forests were sufficiently close to the agricultural areas to allow interspecies transmission.

During the present study it was possible to screen the blood of four monkeys kept at a centre for the reintroduction of captive animals to the wild and the blood of a wild monkey temporarily maintained at a state facility as a result of an accidental injury (all of the monkeys were Alouatta guariba specimens). Simian malaria has already been described in this area [ 29 , 37 ], and one of the four captive animals and the wild specimen were positive both in the blood-smear tests and in the multiplex PCR for P. malariae/brasilianum , confirming that simian malaria is still present in the region.

In addition, the samples of two patients tested negative in multiplex PCR. Fandeur et al. [ 34 ], in their study in French Guiana, also had a similar finding of no detectable PCR product in samples from positive monkeys with low levels of parasitaemia. Since the reaction was able to amplify other blood samples with similarly low parasite counts, they hypothesized that the failure to detect parasites by PCR in animals that were positive in microscopy might be due to sequence variants in the genes studied in regions crucial for primer binding. They questioned the possibility of the existence of still unrecognized parasite species infecting those simians. The same questioning can be applied in the present situation. Since half the patients were negative for antibodies against all synthetic peptides in anti-CSP ELISA, the presence of unrecognized CSP variants is at least possible.

The possibility of malaria introduced by people coming from the Amazon region is remote. ELISA for anti-CSP antibodies was positive for P. vivax VK247 in 6.3% of the residents, but 40% were also positive for P. malariae . Although Curado et al. [ 9 ] described no cross-reaction in their study; it was believed that the possibility of cross-reactivity between these two antigens makes it difficult to establish if all of the 6.3% represent true infection by variant VK 247 or if part of the 6.3% represent false-positive reactions because of infection by P. malariae [ 33 ]. It is worth noting that 51 samples were only positive for P. vivax- like.

Two findings are difficult to interpret. The first is that it is not clear why there were more positive results for females than for males among the samples collected from the residents and tested for anti-CSP antibodies by ELISA. This predominance could have been influenced by some unrecognized factor that affected these findings.

Second, there is the puzzling finding of P. falciparum DNA by multiplex PCR in asymptomatic individuals. As P. falciparum is a virulent parasite, any infection would be expected to result in full-blown disease in non-immune individuals. The fact that these individuals did not present classical symptomatology may be due to the antigenic variability identified in various P. falciparum isolates [ 38 , 39 ]. It has also been observed that in areas of high transmission such as Gabon, the prevalence of asymptomatic P. falciparum carriers increases with age [ 40 ]. Chronic infections with the same parasite in a low-transmission area of Sudan were reported by Hamad et al. [ 41 ]. In riverside populations from Portuchuelo in the state of Rondônia in the Brazilian Amazon, the native inhabitants and oldest inhabitants are those that are less likely to contract malaria [ 42 , 43 ]. Also, the low percentage of subjects who tested positive for this parasite in IFA and the low antibody titres found suggest that transmission is infrequent. In fact, the IFA GMT could represent cross-reactivity to antigens of P. vivax and/or P. malariae . As Deane [ 25 ] and Fandeur et al. [ 34 ] have questioned the possibility of the existence of still-unrecognized simian parasite species and as parasites circulating in simian hosts can be very similar to P. falciparum [ 44 ], it is also possible that those asymptomatic individuals could represent occasional infections by parasites of simian origin. The possibility of false positive results is remote as no other samples infected by P. falciparum were processed by PCR in the laboratory at the time of the study, thus ruling out the possibility of any cross-contamination.

All these intriguing possibilities deserve further investigation. This is the first report of a more comprehensive study that includes an ongoing systematic survey of vector distribution and infection, including captures in two strata of the forest (ground and canopy), and a future search for Plasmodia parasites in the wild monkeys of the area. The authors believe that these research activities will be able to clarify if malaria is a true zoonosis in the state of Espírito Santo.

Conclusión

Malaria in the state of Espírito Santo, Brazil, is caused predominantly by P. vivax with all its variants. The low incidence and isolation among patients make a simple man-to-man transmission cycle unlikely. Furthermore, a greater asymptomatic human reservoir cannot be ruled out, and the evidence of outdoor transmission and the simultaneous occurrence of simian infections with the same parasites raise considerations about the possibility of a simian reservoir.

Autores de las contribuciones

All the authors contributed equally to this work. The authors declare no conflicts of interest.

Agradecimientos

We are grateful to the Department of Health of the state of Espírito Santo for the plentiful support provided in the form of materials, human resources and transportation for the field activities. Special thanks are due to José Carlos Caucho, the laboratory technician who first examined, stored and preserved all the slides collected during the survey. We are also grateful to Priscila Amaro (FAPESP 02/12211-1), Fabiana M. Jordão (FUNDAP) and Maria Dulce Bianchi Rosa for their support in the laboratory work (serology and molecular biology). This study received financial support from Fundação para o Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP 02/03869-3).