PLoS Genetics, 2007; 3(3): (más artículos en esta revista)

Las bases moleculares de gran altura en la adaptación de ciervos ratones

Biblioteca Pública de la Ciencia
Jay F Storz [1], Stephen J Sabatino [1], Federico Hoffmann G [1], Eben J gering [1], Hideaki Moriyama [2], Nuno Ferrand [3], Bruno Monteiro [3], Michael W Nachman [ 5]
[1] Escuela de Ciencias Biológicas, Universidad de Nebraska, Lincoln, Nebraska, Estados Unidos de América
[2] Departamento de Química, Universidad de Nebraska, Lincoln, Nebraska, Estados Unidos de América
[3] Centro de Investigação em Biodiversidade e Recursos Genéticos, Campus Agrário de Vairão, Universidade do Porto, Vairão, Portugal
[4] Departamento de Zoologia e Anthropologia, Facultad de Ciências do Porto, Porto, Portugal
[5] Departamento de Ecología y Biología Evolutiva de la Universidad de Arizona, Tucson, Arizona, Estados Unidos de América
Resumen

Elucidar los mecanismos genéticos de la adaptación es un objetivo de importancia fundamental en la biología evolutiva, sin embargo, pocos estudios empíricos han logrado documentar relación causal entre la variación molecular y organismal fitness en poblaciones naturales. Aquí mostramos una población de análisis genético de dos locus α-globina polimorfismo que subyace adaptación fisiológica a gran altura la hipoxia en las poblaciones naturales de ciervos ratones, Peromyscus maniculatus . Este sistema proporciona una oportunidad excepcional para examinar las bases moleculares de aptitud relacionada con la variación en función de las proteínas que pueden estar relacionados con un bien definido presión de selección. Se encuestó a secuencia de ADN variación en la duplicación de α-genes de globina P. maniculatus de alta y baja altura las localidades (i) para identificar las mutaciones específicas que pueden ser responsables de la divergencia de ajuste de hemoglobina función y (ii) para probar si los genes que la exposición se espera la firma de diversificación de selección entre las poblaciones que habitan en diferentes zonas de elevación. Los resultados demuestran que la proteína funcionalmente distintos alelos se mantiene en un compromiso a largo plazo polimorfismo equilibrado y que las modificaciones de adaptación de la función de hemoglobina son producidos por el independiente o conjunta los efectos de cinco aminoácidos mutaciones que modulan el oxígeno afinidad.

Introducción

Muchos de larga data preguntas sobre los mecanismos genéticos de adaptación siguen sin respuesta debido a la dificultad de integración de datos moleculares con pruebas de causalidad de los efectos sobre organismal fitness. En principio, se pueda avanzar mediante la identificación de las proteínas o los principales componentes clave de las redes de interacción de proteínas que se sabe que mediar una respuesta adaptativa a determinadas reto medioambiental. Análisis de secuencia de ADN, la variación en los genes que subyacen a guiar la determinación de cambios de nucleótidos que son responsables de las modificaciones funcionales de bioquímicos o fisiológicos vías, y también podría arrojar luz sobre el papel de la selección natural en el mantenimiento de la variación observada en la función de las proteínas [ 1, 2]. Aunque este planteamiento tiene grandes posibilidades, muy pocos estudios han documentado una relación mecánica entre la variación alélica en función de las proteínas y fitness relacionados con la variación en todo el organismo fisiología [3 - 7].

La hemoglobina polimorfismo en el ratón venado, Peromyscus maniculatus, representa un sistema especialmente prometedor para el examen de las bases moleculares de adaptación fisiológica a los diferentes entornos. P. maniculatus tiene el más amplio rango altitudinal de cualquier mamífero de América del Norte, como la especie está distribuida de forma continua el nivel del mar para entornos de ambientes alpinos a alturas por encima de 4300 m. En 4.300 m, la presión parcial de oxígeno (P o 2) es de aproximadamente el 55% del nivel del mar valor, y la consiguiente hipoxia impone severas limitaciones en el metabolismo aeróbico. Evidencia experimental indica que la variación de adaptación bioquímica en sangre entre ratones de diferentes elevaciones se asocia con un complejo de hemoglobina polimorfismo [8 - 11]. En concreto, experimental cruza la participación de la naturaleza derivados de las cepas P. maniculatus reveló que la variación de la tensión arterial de oxígeno afinidad está claramente asociada a la variación alélica en dos genes estrechamente vinculada duplicados que codifican la α-cadena de subunidades de la hemoglobina de adultos [12, 13]. En p. maniculatus, los dos α-globina de genes duplicados, HBA y HBC, son cada polimórficos para los dos principales clases detectables por electroforesis de proteínas alelos, HBA 0, HBA 1, HBC 0, y HBC 1 [8, 9, 14, 15]. Estos lugares están estrechamente vinculados, y debido a la fuerte desequilibrio en el ligamiento genético, casi todos los α-Haplotipos se dividen en dos clases principales: a 0 c 0 y un 1 c 1. Los tres genotipos nonrecombinant una exposición muy coherente rango-orden de afinidades de oxígeno en sangre cuando se analizaron en virtud de ambos de alta y baja altitud las condiciones: los ratones con un 0 c 0 / a 0 c 0 genotipo exponer los más altos de afinidad (la mayoría de la izquierda-pasó la curva de disociación oxígeno), los ratones con un 1 c 1 / a 1 c exposición genotipo 1 la más baja afinidad (la mayoría de derecha pasó la curva de disociación), y el a 0 c 0 / a 1 c 1 dobles heterocigotos son intermedios [12, 13]. En estos experimentos, el medio silvestre derivados de las cepas de ratones llevado diferentes α-Haplotipos en idénticos por descendencia condición, y los efectos de los dos genes fueron aislados en contra de un azar genético de fondo.

Además de los efectos sobre la bioquímica de sangre, los efectos fenotípicos de estos α-globina genes se manifiesta también a nivel de toda la fisiología del organismo. En el contexto de la adaptación a gran altura la hipoxia, uno especialmente importante medida de rendimiento es fisiológica V o 2max, que se define como la máxima tasa de consumo de oxígeno provocado por el ejercicio aeróbico o la exposición fría. V o 2max fija el límite máximo en dos importantes tipos fisiológicos de ejecución: capacidad para sostener la actividad (capacidad aeróbica) y la producción de calor interno (termogénico capacidad). Esta medida de rendimiento aeróbico muestra un notable patrón de variación entre los ratones con diferentes α-globina genotipos: V o 2max es más alto para un 0 c 0 / a 0 c 0 ratones cuando se analizaron a una altitud de 3800 m, mientras que V o 2max es más alto para un 1 c 1 / a 1 c 1 ratones cuando se analizaron a 340 m [12, 13].

De acuerdo con las predicciones basadas en consideraciones fisiológicas, estudios de supervivencia libre de alcance P. maniculatus reveló que V o 2max está sujeta a una fuerte selección direccional a gran altura las poblaciones de esta especie [16]. Este sistema, por lo tanto, cumple varios requisitos clave para un estudio exhaustivo de la evolución adaptativa a nivel molecular [3], ya que están claramente definidas las conexiones entre genotipo, fenotipo, y la aptitud darwiniana en las poblaciones naturales.

Los datos fisiológicos indican que la alta afinidad a 0 c 0 / a 0 c 0 genotipo se asocia con el desempeño superior fisiológicas bajo condiciones de hipoxia a gran altura, pero se asocia con malos resultados (en relación a la a 1 c 1 / a 1 c 1 genotipo) de oxígeno en el ambiente rico en el nivel del mar. En ambos extremos de altitud, el a 0 c 0 / a 1 c 1 heterocigotos son generalmente intermedios con respecto a las dos de oxígeno en sangre y afinidad V o 2max [12, 13]. Esta orden de genotípica efectos parece ser atribuible al hecho de que la posesión de alta afinidad hemoglobina facilita la carga pulmonar de oxígeno a gran altitud entornos que se caracterizan por un bajo nivel de P o 2, pero dificulta la liberación de oxígeno al metabolismo de los tejidos a baja altura con entornos relativamente alto de P o 2.

En resumen, este sistema representa un caso único donde la aptitud relacionada con la variación en todo el organismo-la fisiología puede estar relacionada con una proporción relativamente simple fenotipo bioquímico (afinidad de oxígeno en sangre) que tiene un bien caracterizado base genética. Por lo tanto, el examen de la secuencia de ADN, la variación en las α-globina genes específicos revelan los cambios moleculares que subyacen en la adaptación fisiológica a gran altura la hipoxia. Por ejemplo, puede ser posible determinar si las modificaciones de adaptación de hemoglobina función implicar a pocos aminoácidos mutaciones de gran efecto o muchas mutaciones de forma individual efecto pequeño [3, 17]. Las mutaciones de gran efecto que cabía esperar que la participación de hemo-proteína contactos, contactos intersubunit, o sitios de unión para heterotropic ligandos que modulan la hemoglobina-oxígeno afinidad [17 - 20]. Por el contrario, la acumulación gradual de mutaciones menores pueden producir cambios adaptativos en oxígeno a través de afinidad más sutiles y los efectos indirectos sobre la estereoquímica de ligando vinculante. Además de esclarecer los mecanismos moleculares de adaptación fisiológica, el análisis de secuencia de ADN variación en la aptitud relacionada con los genes deben proporcionar información sobre el modo de selección que se encarga del mantenimiento de variación en función de las proteínas.

Aquí mostramos una población análisis genético de los dos locus-α-globina polimorfismo en alta y baja altura de muestras P. maniculatus . Los objetivos son (i) para identificar las mutaciones específicas que pueden ser responsables de la divergencia de ajuste de hemoglobina función y (ii) para comprobar si los patrones de variación nucleotídica a los dos α-globina genes de la esperada exposición de la firma de diversificación de selección entre de alta y baja altitud las poblaciones.

Resultados y Discusión

Estamos incluidos en la muestra un total de 41 ratones de tres localidades a lo largo de un transecto altitudinal que abarca la interfaz entre las Grandes Planicies y el Front Range de las Montañas Rocosas en América del Norte (véase Materiales y Métodos]. El transecto abarcó de 3727 m vertical de socorro durante un distancia lineal de 547 km, desde las praderas de pastizales en Kansas (620 m) hasta la cima del monte. Evans, Colorado (4347 m).

Hemos clonado paralogous dos ejemplares adultos de α-globina de un cribado P. maniculatus biblioteca genómica (ver Materiales y Métodos]. Mediante la realización de capa fina se centra isoeléctrico (IEF) en el análisis de hemolysates silvestres capturados P. maniculatus y se pongan en venta por IEF α-globina a los genotipos deducir las secuencias de aminoácidos por las mismas personas, nos confirmó que el 5 'y 3' α-globina genes están relacionados con la anteriormente descrita la HBA y HBC genes, respectivamente [8 - 10, 12 -- 15]. Sobre la base de electroforético banda densidades, también confirmó que 5 'α-cadena tetramers constituyen la mayor fracción de adultos de hemoglobina en los eritrocitos ciervo ratón y que 3' α-cadena tetramers constituyen la fracción menor de edad [8, 14, 15, 21].

Gene Secuencia de conversión y divergencia entre las dos α-globina Paralogs

Análisis de secuencia de ADN variación reveló que los dos α-globina de paralogs P. maniculatus han experimentado una historia de la conversión parcial de genes: 32,8% de las muestras de 3 'alelos se han convertido en parte de 5' α-globina (mediana del tracto longitud, 114 pares de bases [pb]; rango, 3 a 257 pb), y el 10,8% de las muestras de 5 'alelos se han convertido en parte de 3' α-globina (mediana de duración del tracto, 29 bp; rango, 13 a 225 pb).

Excluidos los alelos de genes identificados con extensiones de conversión, los dos α-globina de paralogs P. maniculatus se distinguen por ocho fijos diferencias en nonsynonymous sitios, que resultan en seis sustituciones de aminoácidos, porque hay dos casos en los que un par de nonsynonymous mutaciones alteran el mismo codón: 34 (B15) Cys / Ser → Glu, 36 (CD1) Phe / Ser → Su, 57 (E6) Gly / Ala → Thr, 58 (E7) Su → Gln, 71 (EF1) Gly / Ser → Asp, y 72 (EF2) → Su ASN (Figura 1]. De los seis sustituciones de aminoácidos que distinguen los dos α-globina paralogs, el 58 (E7) → Gln Su sustitución en el 3 'α-globina gen se prevé que la han funcionales más importantes consecuencias con respecto al ligando vinculante cinética. En todos los mamíferos estudiados hasta la fecha, el E7 de los residuos altamente conservados E-hélice de dominio es una histidina que desempeña un papel fundamental en la reversible vinculante de oxígeno para el hierro hemo. En concreto, la N ɛ átomo de imidazol lado la cadena de hidrógeno forma un vínculo con la libre átomo de la molécula de oxígeno [22 - 24]. En el 3 'α-globina de genes de P. maniculatus, la sustitución de glutamina por histidina en esta posición aumenta la N-O ɛ bonos distancia de 1,1 a 1,9 Å, con lo que producen un menor cambio en las tres dimensiones las coordenadas de la hemo-ligando complejas (Tabla 1]. Estudios de ingeniería de proteínas de la hemoglobina humana han revelado que este 58 (E7) → Gln Su sustitución se traduce en un aumento de oxígeno afinidad a baja P o 2 en relación con de tipo salvaje (E7) Su hemoglobina que contienen [25]. La implicación fisiológica importante es que los eritrocitos de los ciervos ratones contienen una mezcla heterogénea de (E7) y Su-(E7)-Gln isoformas que contienen la hemoglobina que el oxígeno tienen diferentes afinidades vinculante. La posesión de múltiples isoformas de hemoglobina adultos con diferentes afinidades de oxígeno sólo se ha documentado en otro mamífero, el yak, Bos grunniens [26], que habita en ambientes de alta montaña a alturas de hasta 5400 m en la meseta tibetana. La posesión de múltiples isoformas de hemoglobina también se ha documentado en las aves que vuelan a gran altitud [17, 19, 27 - 30]. Estos patrones sugieren la hipótesis de que la posesión de múltiples isoformas de hemoglobina proporciona un mecanismo de ajuste de oxígeno en sangre afinidad en respuesta al ambiente variación en la tensión de oxígeno (en el caso de animales que la experiencia de oxígeno diferentes ambientes en un diario o estacional) o en respuesta a la variación en las demandas metabólicas de manera uniforme en un ambiente hipóxico. En el caso de los ciervos ratones, una evidente predicción de esta hipótesis es que algún mecanismo de control reglamentario permite la stoichiometric ratio de 5 'y 3' α-cadena de hemoglobina isoformas que se ha de ajustar en respuesta a la demanda metabólica.

Funcional divergencia entre los dos α-globina de paralogs P. maniculatus está en marcado contraste con el patrón de evolución concertada que se ha documentado para la α-globina paralogs de casi todos los demás mamíferos estudiados hasta la fecha [31]. Por ejemplo, la α-globina de genes duplicados de los seres humanos suelen ser idénticos en secuencia y por lo tanto codificar polipéptidos idénticos [32].

Patrones de polimorfismo y la divergencia

Incluso después de contabilidad para compartir los polimorfismos que son atribuibles a la conversión de genes entre los dos α-globina paralogs, ambos genes se caracterizan por niveles extremadamente altos de diversidad de nucleótidos a ambos sitios en silencio (y sinónimo noncoding) y la sustitución sitios (Cuadro 2]. En el 3 'α-globina gen, la conversión extensiones abarcan grandes porciones de la secuencia de codificación y de resultado en un 1,51 veces mayor en el total de diversidad de nucleótidos. Además de la variación introducida por la conversión de genes entre los dos paralogs, ambos genes también han experimentado altas tasas de recombinación intragenic (R M, el número mínimo inferirse de los eventos de recombinación = 14 para 5 'α-globina, 95% intervalo de confianza = 6 a 16, y R M = 8 para 3 'α-globina, 95% intervalo de confianza = 5 a 14).

El 3 'α-globina de orthologs P. maniculatus y un congénere estrechamente relacionados, Peromyscus leucopus, se distinguen por siete sustituciones de aminoácidos: 23 (B4) → Gln Asp, 47 (CD12) Su → Asp, 50 (CD15) → Su Pro, 57 (E6) → Gly Thr, 58 (E7) Gln → Su, 71 (EF1) ASN → Asp, y 113 (GH1) Su → Gln (Figura 1]. Por el contrario, no hay fijo de aminoácidos diferencias entre el 5 'α-globina orthologs de estas dos especies. Dentro de p. maniculatus, ambos genes presentan una amplia sustitución de aminoácidos polimorfismo: 5 'α-globina segrega 21 nonsynonymous mutaciones y 3' α-globina segrega 33 nonsynonymous mutaciones. Para neutral genes que están evolucionando bajo la influencia de la mutación y deriva genética, el nivel de especies dentro de polimorfismo se espera que se observa una correlación positiva con el nivel de entre la divergencia de especies, y esta correlación debe celebrar para los dos en silencio y la sustitución cambios [ 33]. Para comprobar si una salida de este neutral expectativa, hemos utilizado el test exacto de Fisher de la independencia para evaluar si la proporción de aminoácidos de reemplazo para los polimorfismos en silencio en cada uno de los dos α-genes de globina P. maniculatus difiere de la relación de sustitución de fijo en silencio las diferencias en comparación con sus respectivos orthologs en P. leucopus . Excluidos los alelos de genes identificados con extensiones de conversión, las pruebas revelaron que ambos genes se caracterizan por un exceso significativo de sustitución polimorfismo (Tabla 3]. En los 5 'α-globina de genes, diez de las 21 mutaciones nonsynonymous alelo presentó más frecuencia las diferencias entre alta y baja altitud muestras, y en seis de estos sitios, se obtendrá una mutación estuvo presente en una frecuencia superior a 0,10 en la alta - altura muestra. En el 3 'α-globina gen, 21 de las 33 mutaciones nonsynonymous alelo presentó más frecuencia las diferencias entre alta y baja altitud muestras, y en ocho de estos sitios, se obtendrá una mutación estuvo presente en una frecuencia superior a 0,10 en la alta - altura muestra (Tabla S1]. Este patrón de polimorfismo es coherente con un modelo de diversificación de selección que favorece a las diferentes variantes de la proteína en diferentes zonas de elevación [9, 21].

Desequilibrio en el ligamiento genético y diferenciación altitudinal

En contraste con los patrones de variación nucleotídica a otros cinco disociados nuclear loci, tanto α-globina paralogs exhibió una muy importante exceso de intragenic desequilibrio en el ligamiento genético tal como se desprende de Kelly's Z ns estadística [34] (Tabla 4]. Este exceso de desequilibrio en el ligamiento genético, en combinación con los niveles extremadamente altos de diversidad de nucleótidos a ambos genes, es coherente con un modelo de diversificación de selección en los que el mantenimiento del equilibrio polimorfismo produce nonrandom asociaciones entre alelos que son específicos para los distintos orígenes haplotipo [35, 36 ]. Además de altos niveles de desequilibrio en el ligamiento genético en tanto α-globina paralogs, intergénicas comparaciones de sustitución de aminoácidos polimorfismo revelado un nivel muy importante de vinculación genotípica desequilibrio entre las dos paralogs (p <0,001). Este resultado es coherente con la pauta de dos locus desequilibrio en el ligamiento genético documentado en anteriores estudios de electroforesis [8, 14, 15, 21].

En principio, debería ser posible determinar si un determinado polimorfismo está sujeta a selección divergentes entre los distintos ambientes mediante la comparación de la legitimación de un determinado nivel de diferenciación a un promedio de multilocus disociados marcadores neutral [37, 38]. Una vez más, en consonancia con un modelo de diversificación de selección entre las diferentes zonas altitudinales, tanto α-globina genes se caracterizan por mayores niveles de diferenciación de altitud superior a cinco otras disociados nuclear loci (Tabla 4]. Sin embargo, es importante reconocer que las estimaciones puntuales de diferenciación genética tiene una gran diferencia, que se deriva principalmente de estocástico diferencia entre las genealogías de disociados loci. Para tener en cuenta esta fuente de diferencia, hemos utilizado coalescent simulaciones para generar una nula distribución de sitio específico F-ST valores en virtud de un modelo neutral de la estructura de la población (véase Materiales y Métodos]. Para cada uno de los dos α-globina genes, la nula distribución de esta forma se utilizó para determinar los polimorfismos de reemplazo que exhiben los niveles de diferenciación altitudinal que son demasiado altos para ser explicada por la deriva por sí solo.

Si el oxígeno arterial alta afinidad representa una condición derivada de gran altura ciervos ratones, luego de elevados niveles de altitud en la diferenciación específica α-globina polimorfismos debe ser atribuible al aumento de la frecuencia derivados de mutaciones en el gran altura población. Así, los mejores sitios candidatos para la selección divergentes en función de hemoglobina son aquellas que se caracterizan por una inusualmente alto valor F ST y un inusualmente alta frecuencia de los alelos derivados a gran altura. En los 5 'α-globina de genes, sustitución de polimorfismos en cinco estrechamente vinculada posiciones de residuos, 50 (CD15) Su / Pro, 57 (E6) Gly / Ala, 60 (E9) Ala / Gly, 64 (E13) Asp / Gly, y 71 (EF1) Gly / Ser, y una posición más distante, 116 (GH4) Glu / Asp, se caracterizaron por el mayor sitio específico F-ST valores en las comparaciones entre la alta altitud muestra (Mt. Evans, Colorado, Estados Unidos Estados) y cada uno de los dos baja altitud muestras (Yuma County, Colorado, y Pawnee County, Kansas, Estados Unidos), y específicos de cada sitio, los niveles altitudinales de diferenciación neutral superó las expectativas en ambas comparaciones pairwise (Figura S1 A y S1 B) . La sustitución de polimorfismos en los lugares 50, 57, 60, 64, y 71 son muy significativas en relación con el desequilibrio entre sí (p <0,00001 pairwise en todas las comparaciones) y con el sitio 116 (p <0,025 en todas las comparaciones pairwise; Figura 2 ). Nonrandom Estas asociaciones no son únicamente atribuibles a la reducción de la recombinación, como pairwise desintegración vinculaciones desequilibrios a los niveles de fondo a una distancia de menos de 600 pb en el gen (Figura S2]. El hecho de que dos locus-α-globina haplotipos se mantienen a pesar de este corto alcance en decadencia desequilibrio en el ligamiento genético es coherente con la hipótesis de Chappell et al. [13] que coadapted combinaciones de alelos de proteínas en los dos genes son mantenidos por los epistatic selección.

En el caso de los sitios 50, 64, y 71, los derivados variantes están presentes en inusualmente alta frecuencia en la alta altitud muestra (Tabla S1] y monotónica exhiben un aumento en la frecuencia como una función positiva de altura (Figura 3]. Por otra parte, los altos niveles de diferenciación en los cinco estrechamente vinculada sustitución polimorfismos (sitios 50, 57, 60, 64 y 71) y la sustitución polimorfismo en el sitio 116 se encuentran cada uno de ellos asociado con elevados valores de F ST estrechamente vinculado a los sitios en silencio (Figura S1] . Debido a los resultados de la simulación sugieren que observó los niveles de altitud en la diferenciación de estos seis polimorfismos de reemplazo son demasiado altos para ser explicada por un modelo neutral de la estructura de la población, los elevados valores de F ST estrechamente vinculado a los sitios en silencio puede deberse a hitchhiking genéticos [39, 40 ].

De los seis sustitución polimorfismos en 5 'α-globina que muestran mayor de lo previsto F ST valores, la 64 (E13) Asp / Gly polimorfismo se prevé que la han funcionales más importantes consecuencias con respecto al oxígeno vinculante cinética de la hemoglobina proteína. En el sitio 64 (E13), la sustitución de glicina descargadas de residuos de la carga negativa de residuos de ácido aspártico implica la sustitución de un solo átomo de H secundarios para una cadena mucho más grande CH 2-COOH cadena lateral (Figura 4]. Como resultado de la carga y el tamaño de las diferencias entre estos dos residuos de aminoácidos, este 64 (E13) Asp Gly → sustitución reduce steric obstáculo para el oxígeno obligatorio en el bolsillo y hemo se prevé para producir un aumento sustancial de oxígeno afinidad (Cuadro 5]. El efecto previsto de esta mutación se ve corroborada por los estudios funcionales de la misma 64 (E13) Asp Gly → mutación en humanos de hemoglobina. Funcionales estudios revelaron que la rara variante de hemoglobina, definida por el 64 (E13) Asp Gly → mutación ", hemoglobina Cantón-Hangzhou", se caracteriza por un aumento de oxígeno afinidad [41, 42].

En resumen, los eritrocitos de los ciervos ratones contienen una extraordinaria diversidad de funcionalmente distintas isoformas de hemoglobina, debido a la variación entre duplicados α-globina genes, además de que la variación alélica es segregar a cada uno de los dos genes. Sugerimos que funcionalmente importantes mutaciones que distinguir las dos α-globina paralogs, como el 58 (E7) → Gln Su sustitución en el 3 'α-globina de genes, son los principales implicados en el mantenimiento de un fisiológicas división del trabajo entre 5' y 3 'Α-cadena de hemoglobina tetramers y pueden, por tanto, proporcionar un marco normativo de reserva de capacidad de transporte de oxígeno. Por el contrario, funcionalmente importantes mutaciones que distinguir de alta y baja altura alelos, como el 64 (E13) Asp / Gly polimorfismo en el 5 'α-globina de genes, son los principales implicados en la adaptación de hemoglobina función a las diferentes zonas altitudinales.

Prueba para el Mantenimiento de Adaptive equilibrado polimorfismo

Cuando dos o más alelos distintos funcionalmente son mantenidos por alguna forma de equilibrar la selección, tales como la diversificación de selección que favorece a diferentes genotipos en los hábitats separados espacialmente, coalescencia veces para secuencias pertenecientes a diferentes selectiva definido alelo clases se espera que sean mucho más largos que los de secuencias pertenecientes a un mismo alelo de clase [35, 36, 40, 43, 44]. En consecuencia, las comparaciones de las secuencias de variación entre las diferentes clases alelo debe revelar un pico pronunciado en la divergencia de nucleótidos que se centra en el sitio seleccionado que define las diferentes clases. Para determinar si los dos α-globina paralogs exhiben esta característica la firma de la diversificación de la selección, nos llevó a cabo una ventana deslizante de análisis de silencio sitio diversidad en las comparaciones entre funcionalmente distintas clases de alelos de cada uno de α-globina gen. Silent in situ la diversidad dentro de cada alelo de clase se calculó de π [45], y en silencio el sitio divergencia entre alelo clases se estimó de D xy, el número promedio de sustituciones de nucleótidos por sitio (Ecuación 12,65 a Nei y Kumar [45]]. En el caso de los 5 'α-globina, la ventana deslizante-análisis puso de manifiesto un marcado pico de silencio sitio divergencia en las comparaciones entre los alelos se define por los cinco estrechamente vinculada sustitución polimorfismos que abarcan la E-hélice de dominio del polipéptido codificado (sitios 50, 57, 60, 64 y 71; Figura 5]. Este pico de silencio sitio divergencia entre las dos clases de alelos está directamente centrada en la región del exón 2, que alberga las cinco clases de la definición de los polimorfismos de sustitución, como predijo si uno o más de estos sitios representa el objetivo de selección divergentes [35, 40, 43]. En la ventana que abarca esta región del exón 2, silenciosa sitio divergencia entre las dos clases de alelos es 0,121 (Jukes-Cantor corregida), un valor que supera las estimaciones del promedio de silencio sitio divergencia entre el 5 'α-globina de orthologs P. maniculatus y P. leucopus (Cuadro 2]. Este extraordinariamente alto nivel de secuencia de divergencia entre las dos clases de alelos es coherente con el mantenimiento de dos proteínas funcionalmente diferentes alelos como un compromiso a largo plazo equilibrado polimorfismo.

Sobre la base de deducir los puntos isoeléctricos de las traducido secuencias de aminoácidos, el sitio de cinco proteínas haplotipo que predomina en las alturas (50Pro/57Gly/60Ala/64Gly/71Ser) y el haplotipo alternativa que predomina a baja altitud (50His/57Asp/60Gly / 64Asp/71Gly) son los relacionados con la HBA 0 y HbA 1 alelos, respectivamente, de Snyder et al. [21]. El rango previsto de fin de oxígeno vinculante afinidades de estos alelos (cuadro 5] también es compatible con los anteriores resultados experimentales [10, 12, 13]. Sobre la base de experimentos fisiológicos anteriores [12, 13], la "gran afinidad" proteína haplotipo se espera que confieren mayor rendimiento fisiológico en virtud de las condiciones de hipoxia a gran altura, mientras que la alternativa "baja afinidad" haplotipo se espera que confieren mayor rendimiento fisiológico a baja altura. El hecho de que el 5 'α-globina gen exhibe una clara diversificación de la firma de selección es coherente con la idea de que las proteínas con diferentes alelos de oxígeno son vinculantes a favor de afinidades en diferentes zonas de elevación [9, 10, 12, 13, 21].

Porque hemoglobinas de diferentes especies se distinguen por lo general múltiples sustituciones de aminoácidos, sólo una fracción de lo que puede ser funcionalmente importante es que a menudo son difíciles de identificar la causal variantes que participan directamente en molecular adaptación a diferentes ambientes. Especies como P. maniculatus ofrecer la oportunidad de identificar los aminoácidos específicos de los cambios que están involucrados en la adaptación de hemoglobina porque es posible comparar las secuencias funcionalmente distintas de alelos que se distinguen por un número relativamente pequeño de mutaciones. Adaptive modificaciones de la hemoglobina función son por lo general piensa que participan los principales cambios en hemo-proteína contactos [como el 58 (E7) → Gln Su sustitución que distingue a los dos α-globina paralogs], intersubunit contactos, o sitios de unión de ligandos heterotropic [17 -- 20]. En contraste con esta opinión predominante, la variación en la secuencia 5 'α-globina revela que la mayor afinidad de oxígeno de la alta altitud de proteínas alelo se debe principalmente a un cambio de cargo-64 (E13) Asp Gly → mutación en el exterior de la E - hélice que reduce steric obstáculo para el oxígeno obligatorio en el bolsillo hemo. Los resultados de este estudio ponen de manifiesto, por tanto, un inesperado mecanismo subyacente alélica diferencias en la hemoglobina-oxígeno afinidad.

La genética de la población de análisis de α-globina polimorfismo también ofrece la oportunidad de evaluar el posible significado adaptativo de epistasis entre las diferentes mutaciones en el gen mismo. Por ejemplo, en el caso de los 5 'α-globina, de los derivados de glicina mutantes en el sitio 64 (E13) es casi perfecto en relación con los desequilibrios derivados de prolina mutantes en el sitio 50 (CD15). La última de residuos se encuentra en un exterior, interhelical segmento de la α-globina polipéptido y, por tanto, no tiene efecto directo sobre ligando vinculante. Sin embargo, cabe señalar que el cambio de una carga positiva de residuos histidina a un descargadas de residuos de prolina en el sitio 50 (CD15) compensa exactamente el cambio de una carga negativa de residuos de ácido aspártico a un residuo de glicina descargadas en el sitio 64 (E13). Esto sugiere la hipótesis de que el 64 (E13) Asp Gly → mutación representa el principal cambio de adaptación que produjo el aumento de la hemoglobina-oxígeno afinidad y que el 50 (CD15) Su → Pro mutación representa un cambio de compensación que mantiene la misma superficie neta de cargo la molécula. Funcional experimentos con sitio de mutagénesis dirigida se requiere para medir las independiente y conjunta los efectos de estas mutaciones en la hemoglobina-oxígeno afinidad. Además de la posible función de epistasis entre mutaciones en el gen mismo, más trabajo es también necesaria para evaluar el potencial de epistatic interacciones entre genes, como la α-y β-globina loci que codifican subunidades interactuando de la misma proteína tetrameric.

Materiales y Métodos
Las muestras.

Los animales fueron capturados vivos y manipulados de conformidad con el Cuidado de Animales institucional y el empleo directrices del Comité. Los tamaños de las muestras, muestra las localidades, y muestra los números son los siguientes: la cumbre del monte. Evans, Clear Creek County, Colorado (4347 m, n = 15, JFS 70, 71, 73, 74, 76, 80 a 82, 87, 88 , 95, 97, 98, 100 y 106), Bonny Reservoir, Yuma County, Colorado (1158 m, n = 15, JFS 107, 114, 117, 122 a 124, 132, 134 a 137, y 140 a 143) , Y Fort Larned Monumento Nacional, Pawnee County, Kansas (620 m, n = 11, NK 53239, 53245, 53247 a 53249, 53251, 53252, 53256, 53265, 53266 y 53268). Después de cada ratón fue asesinado, toda la sangre se recogió por punción cardíaca (en el caso de ratones obtenidos de Mt. Evans y del Condado de Yuma) y el tejido hepático se congeló en nitrógeno líquido como fuente de ADN genómico. Los especímenes fueron depositados en la colección de vertebrados en la Universidad de Nebraska Museo del Estado y el Museo del Suroeste de Biología, Universidad de Nuevo Mexico. Se extrajo el ADN de hígado congelado de cada ratón utilizando carpetas de DNeasy (Qiagen, http://www.qiagen.com ).

La clonación y secuenciación de los genes de globina.

Adultos α-globina genes se duplican en casi todos los mamíferos, incluidos los Peromyscus [8, 31, 46]. Por lo tanto, antes de la realización de encuestas de población a nivel de variación individual en α-globina genes, es necesario en primer lugar a caracterizar la estructura genómica de la α-globina familia de genes con el fin de diseñar locus-PCR primers específicos que no coamplify paralogous genes duplicados o pseudogenes. El uso de locus de primers específicos es fundamental porque nos permite distinguir entre la variación alélica segregar a un solo gen frente a la variación entre los genes duplicados. Para aislar y caracterizar la α-genes de globina P. maniculatus hemos examinado un bacteriófago λ-genómica utilizando la biblioteca lambda FIX II / XhoI parcial de relleno en el vector kit (Stratagene, http://www.stratagene.com ). Hemos clonado con éxito uno de los dos α-globina paralogs (3 'α-globina) en un único fragmento que abarca aproximadamente 16,5 kb de Peromyscus cromosomas 13, que es syntenic a Mus cromosoma 11. A continuación, utiliza cebadores degenerados de los 5 'y 3' de acompañamiento a las regiones a amplificar y secuenciar los demás paralog (5 'α-globina). El diseño del lugar de primers específicos nos permitió ampliar y secuencia de aproximadamente 900 bp fragmentos que contienen toda la secuencia de codificación de cada una de las α-globina paralogs.

Con el fin de resolver el haplotipo de cada fase de α-globina paralog (es decir, asociar a los nucleótidos en sitios múltiples heterocigotos), hemos aprobado un protocolo experimental que participan tanto la clonación alelos de los productos PCR diploide en todos los individuos. Después de la clonación diploide productos PCR en pCR4 TOPO-vector (Invitrogen, http://www.invitrogen.com ), Que completa la secuencia de codificación de la región e intervenir intrones de al menos 16 alelos por clonados de ratón (al menos ocho alelos clonado por paralog). Esta intensidad de mano de obra estrategia que ofrece dos importantes ventajas: (1) hemos recuperado diploide genotipos para la región de codificación completa de ambos α-globina paralogs, y (2) hemos recuperado el haplotipo fase exacta de todos los sitios heterocigótica.

También obtuvo una secuencia representante de la β-globina de genes P. maniculatus con el fin de construir una precisa homología estructural basado en el modelo de hemoglobina tetramer. Primers para β-globina fueron diseñados utilizando una alineación de secuencias de orthologous humanos, Rattus, y Mus, además de publicada la secuencia de parte de la β-globina de codificación región en Peromyscus [47]. Luego utilizó un genoma de caminar enfoque para caracterizar los 5 'y 3' de acompañamiento secuencia, y esto nos ha permitido diseñar cebadores que amplifican la región de codificación completa.

Los genes de globina fueron PCR-amplificación utilizando Ampli Taq Gold-química (Applied Biosystems, http://www.appliedbiosystems.com ) Bajo los siguientes parámetros en bicicleta: 94 ° C (120 s) de desnaturalización inicial, [94 ° C (30 s), 58 ° C (30 s), 72 ° C (60 s)] 30 veces, y una última prórroga a 72 ° C (120 s). Primer secuencias se enumeran en el cuadro S2. El mismo PCR primers también se utilizaron para la secuencia de reacciones, a pesar de temperatura se incrementó hasta los 60 ° C. M13 se utilizaron cebadores para amplificar los productos clonados (55 ° C, temperatura) y T7/T3 primers internos fueron utilizados para la secuenciación. Todas las reacciones de secuenciación de muestras y se ejecute en un capilar ABI 3730 secuenciador utilizando la química Dye Terminator (Applied Biosystems). Para cada uno de los dos α-globina de genes duplicados, hemos utilizado orthologous una secuencia de especies afines, P. leucopus, para estimar la divergencia y para inferir el ancestrales y derivados variantes en cada sitio en segregar P. maniculatus .

Disociados nuclear loci.

A efectos de comparación con la α-globina genes, se utilizó una muestra de 30 ratones de monte. Evans y del Condado de Yuma para estudiar la variación de secuencias de ADN a otros cinco disociados nuclear loci: β-fibrinógeno (614 bp), vimentina (785 bp ), LCAT (456 bp), RAG1 (1183 bp), y AP5 (385 bp). Cada uno de los cinco loci fueron PCR-amplificación como se ha descrito anteriormente y luego fueron secuenciados directamente en el ABI 3730. Primers secuencia de genes y regiones para cada locus marcador se enumeran en el cuadro S2. Después de la primera secuencia directa la obtención de datos para completar la muestra de 30 ratones, hemos clonado los dos alelos de más de 80% de las personas que fueron heterocigotos en múltiples sitios. A continuación, utiliza el programa de FASE [48, 49] para inferir haplotipo fase para el resto de las personas. Se encontró que por verificar experimentalmente haplotipo fase para un gran número de heterocigotos múltiples, el programa de FASE fue capaz de resolver el resto de haplotipos con un alto grado de confianza.

IEF análisis de la variación de proteínas.

Los experimentos originales que documentan la asociación entre el fenotipo fisiológico y α-globina genotipo en P. maniculatus se basa en la electroforesis en gel y de capa fina IEF análisis de la variación de proteínas [8 - 13]. Con el fin de relacionar los resultados de nuestro análisis de secuencias de ADN a esta obra publicada con anterioridad, nos llevó a cabo una gradiente inmovilizado, de capa fina IEF análisis para obtener genotipos electroforético de proteínas para el mismo ratones que hemos utilizado en el análisis de secuencia de ADN variación. Al asociar deducir las secuencias de aminoácidos de cada alelo a la observada IEF genotipos, hemos identificado los cambios de aminoácidos que constituyen la base de las diferencias en punto isoeléctrico entre los alelos de proteínas 5 'α-globina (la HBA 0 y HbA 1 alelos de Snyder et al . [21]]. Hemolysates y globina muestras se elaboraron a raíz Ferrand [50, 51], y de capa fina IEF se llevó a cabo en geles de poliacrilamida (pH 7,1 a 8,1).

Modelado de estructura-función en las relaciones de ciervo ratón de hemoglobina.

Las estructuras primarias de la α-y β-globina de polipéptidos P. maniculatus Se deduce de las secuencias de ADN traducidas (Figura 1]. Para construir una homología basadas en el modelo de ciervo ratón de hemoglobina, hemos utilizado la P. maniculatus secuencias de aminoácidos a las plantillas de búsqueda estructural en el rompecabezas 3D-[52] y SWISS-MODEL [53] servidores Web. El resultado de homología de los modelos fueron evaluados utilizando la cristalografía de proteínas Procheck programa de la suite CCP4 [54]. Todos los análisis estructurales de la minería, incluyendo las superposiciones y el cálculo de distancias interatomic, se realizaron con Suiza-AP Viewer [55]. Los cálculos de los entes locales de minimización de energía de enlace se realizaron utilizando AutoDock [56]. Todas las representaciones gráficas de estructuras moleculares se prepararon utilizando PyMOL (Delano Científico, http://www.delanoscientific.com ).

El análisis de datos genéticos.

Las secuencias de ADN fueron alineados y contigs se reunieron utilizando el programa Sequencher (Gene Codes, http://www.genecodes.com ). Todas las secuencias fueron verificados por la inspección visual de cromatogramas. Para detectar indicios de conversión génica (nonreciprocal recombinación) entre los dos α-globina paralogs, hemos utilizado un algoritmo de máxima verosimilitud para estimar ψ, por el sitio probabilidad de detectar un gen conversión entre las dos secuencias paralogous [57]. Para detectar pruebas de recombinación dentro de cada uno de los dos α-globina paralogs, hemos utilizado los cuatro gametos prueba de Hudson y Kaplan [58] para estimar R M, el número mínimo de recombinación acontecimientos en la historia de la muestra, y hemos utilizado coalescent simulaciones para obtener el 95% intervalos de confianza para las estimaciones.

Para cada pairwise nonsynonymous combinación de polimorfismos de nucleótido, hemos probado la hipótesis nula que los genotipos en un sitio son independientes de los genotipos a un segundo lugar exacto de realización de las pruebas sobre las tablas de contingencia de genotipos diploides. Estas pruebas se realizaron para, sitio por sitio comparaciones entre los dos α-globina paralogs. Para obtener una medida resumen de dos locus desequilibrio en el ligamiento genético entre las dos α-globina paralogs, hemos utilizado el índice de asociación, I A [59, 60], y la prueba de asociaciones significativas usando la prueba de aleatorización Agapow y Burt [61] . En las pruebas de aleatorización, cada uno de los dos α-globina paralogs se tratan de forma separada, vinculación y grupos de permutaciones de los genotipos diploides se limita a cada grupo. De este modo, el exceso de desequilibrio en el ligamiento genético en los datos observados en relación con los datos al azar se puede atribuir a nonrandom asociaciones entre los dos paralogs. Del mismo modo, las permutaciones de genotipos dentro de cada grupo de vinculación se limita a cada una de las muestras de población. De este modo, el exceso de desequilibrio en el ligamiento genético en los datos reales relativos a los datos al azar no puede atribuirse únicamente a la diferenciación genética entre las de alta y baja altitud muestras. Por último, la conversión de genes identificados extensiones fueron tratados como los datos que faltan y se fija en lugar de la aleatorización pruebas, garantizando así que la distribución real de los datos que faltan se conservan en los archivos de datos al azar.

Resumen de las estadísticas de polimorfismo y la divergencia se calcularon con los programas SITIOS [62] y DnaSP v4.0 [63]. Para evaluar si los niveles observados de intralocus desequilibrio en el ligamiento genético se desvió de expectativas neutras, realizamos pruebas de neutralidad sobre la base de Kelly's Z ns estadística [34]. Para obtener los valores críticos para esta prueba estadística, que generó una nula distribución de los valores Z ns coalescent mediante el uso de simulaciones para generar 10000 neutral genealogías que fueron acondicionados en las estimaciones de ρ (= 4 Nc, donde N es el tamaño efectivo de la población y es la c tasa de cruzar entre los sitios adyacentes) [64]. Para medir los niveles de diferenciación genética entre alta y baja altitud las muestras, se calcularon las Weir y Cockerham's [65] estimador de F ST para cada polimorfismo de nucleótido único, y hemos utilizado el estimador de Hudson et al. [66] para calcular una medida análoga para la diferenciación de secuencia completa haplotipos. Para determinar si los polimorfismos de aminoácidos en la α-globina genes exposición inusualmente altos niveles de diferenciación altitudinal que puede atribuirse a la diversificación de la selección, hemos utilizado coalescent simulaciones para generar las distribuciones nulas de sitio específico F-ST valores en virtud de un modelo neutral de la estructura de la población. En concreto, hemos utilizado observado niveles de diferenciación en silencio-a sitios parameterize 100-Deme la isla modelo de la estructura de la población en la que la tasa de migración simulada entre cada par de la muestra Demes se fijó igual al valor que produjo la media observada valor F ST. Para cada α-globina gen, hemos utilizado coalescent simulaciones para generar 10000 neutral genealogías que fueron condicionadas por el tamaño de la muestra real y las estimaciones de θ (= 4 μ N, donde N es el tamaño efectivo de la población y μ es la tasa de mutación) [67 ]. Separe las distribuciones de F ST valores fueron generados por una ventana deslizante de 50 pb que fue colocado a 10-bp incrementos a lo largo de cada una de las dos α-globina genes.

Apoyo a la Información
Variación en el sitio niveles específicos de altitud a través de la diferenciación 5 'α-globina de Gene
(A) Comparación entre alta y baja altitud muestras (Mt. Evans, Colorado [4347 m] versus Pawnee County, Kansas [620 m]).
Relación con otros pairwise desequilibrio en el ligamiento genético y la distancia en bp
Relleno símbolos denotan 201 pairwise asociaciones que son importantes por una prueba exacta de Fisher tras la corrección de Bonferroni
Variación de aminoácidos en la α-Los genes de globina de alta y baja altitud Deer Ratones
(80 KB DOC)
Información adicional sobre Secuenciado loci
(64 KB DOC)

Damos las gracias a J. Hatt, Isoe J., y M. Goodisman para ayudar con la biblioteca genómica de cribado, C. y J. Dingle Waite para ayudar con la clonación y secuenciación, D. Armstrong para el préstamo de trampas Sherman, T. Yates préstamos para la obtención de tejidos del Museo del Suroeste de Biología (Universidad de Nuevo Mexico), y L. Harshman, T. Zera, y cuatro revisores anónimos por los comentarios sobre el manuscrito.