Mediators of Inflammation, 2007; 2007: (más artículos en esta revista)

Citoquinas Th1/Th2 proporción en los tejidos Transudados de pacientes con liquen plano oral

Hindawi Publishing Corporation
Nelson L. Rhodus [1, 2], Bin Cheng [3], Frank Ondrey [2]

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Resumen

Objetivo. Las características del liquen plano oral (LPO) provocar a los investigadores a estudiar los posibles marcadores biológicos que permitan monitorear la actividad de la enfermedad y la eficacia terapéutica. Fluidos orales pueden proporcionar un medio accesible para el análisis de biomarcadores tales. Estudios anteriores han demostrado que la activación del factor nuclear kappa B (NF-κ B) desempeña un papel importante en la patogénesis del liquen plano oral (LPO), que es un trastorno inflamatorio crónico mediada por células T. Con anterioridad a la presente investigación, los informes de los niveles de NF-κ B, y sus citocinas en los fluidos orales no se han próxima. El objetivo de este estudio fue detectar el nivel de NF-κ B dependientes de citoquinas, TNF-alfa, IL-1-alfa, IL-6 y IL-8 en tejido Transudados directamente de las lesiones de LPO, y explorar la viabilidad de los datos para su aplicación clínica. Diseño del estudio. Trece definitivamente diagnosticados OLP temas se matricularon en el estudio así como 13 de edad-sexo controles pareados. En cada tema, lesión de tejidos Transudados (TTS) han sido recogidos de una novela técnica de recolección con un filtro de papel. El nivel de citoquinas, TNF-alfa, IL-1-alfa, IL-6 y IL-8 en tres tipos de fluidos orales se determinó por ELISA. Resultados. En el tejido trasudado (TT), fue significativamente más alto nivel de citoquinas TNF-alfa, IL-1-alfa, IL-6 y IL-8 OLP detectado en los pacientes que en los controles: (TT: 40,0 ± 9,8 frente a 4,5 ± 0,7, 710 ± 114 vs 305 ± 78, 150 ± 25 frente a 1,7 ± 0,5, 2800 ± 260 versus 1450 ± 130, P <.0001; unidad: pg / mL). Conclusiones. Estos resultados indican que el NF-κ B dependientes citoquinas inflamatorias pueden ser detectados en el aumento de los niveles en los tejidos orales Transudados lesión que puede tener el diagnóstico y pronóstico para el seguimiento de los potenciales de la actividad de la enfermedad y toma decisiones terapéuticas en pacientes con LPO.

1. INTRODUCCIÓN

La evidencia de investigaciones a través del ratón y modelos humanos ha indicado que las células T helper pueden clasificarse en al menos dos subconjuntos funcionales, Th1 y Th2, sobre la base de sus perfiles de citoquinas. Las células Th1 se caracteriza por la producción de IL-2, IFN-γ y TNF-β y son fundamentales en la inmunidad celular, pero las células Th2 se caracteriza por la producción de IL-4, IL-5, IL-6, e IL-13 y desempeñado un papel importante en la inmunidad humoral. Estos dos subconjuntos Th regulado mutuamente a través de la función de la actividad antagonista de sus respectivas citoquinas que determina en gran medida las características de la respuesta inmune y la evolución [1, 2]. Muchos estudios han demostrado una estrecha relación entre el desequilibrio Th1/Th2 y la patogénesis de una serie de trastornos autoinmunes como la Enfermedad de Behcet (dominante respuesta Th1), síndrome de Sjogren secundaria a hepatitis C, la infección por el virus (respuesta Th2 dominante), psoriasis (dominante respuesta Th1), y otros [3 - 5]. El aumento de las evidencias mostraron que el balance de la respuesta inmune entre Th1 y Th2 determinará los resultados de las enfermedades y la modulación de desequilibrio Th1/Th2 se convirtió en una nueva estrategia terapéutica de algunas enfermedades autoinmunes, por ejemplo, IL-4 en la psoriasis, anti-CD4 en el anticuerpo monoclonal experimental artritis, y IFN-γ-corticosteroides en el asma resistente [6 - 8].

El liquen plano oral (LPO) es un trastorno inflamatorio crónico caracterizado por una de células T mediada por la respuesta inmune contra las células epiteliales, con la acumulación persistente de los linfocitos T y células epiteliales daños. Estudios previos han descrito el patrón de expresión de las diferentes citocinas y quimiocinas, que participan en Th1 y / o polarización Th2, en los tejidos, las células cultivadas, y el suero de pacientes con LPO, incluyendo IL-2 [9 - 11], IFN-alpha [11 - 14], TNF-alfa [9, 11, 12, 15 - 18], IL-4 [9, 12, 18], IL-6 [11, 13, 18, 19], IL-10 [9 , 12, 18], y TGF-alfa [9, 12, 20], IL-1 [18], IL-8 [21, 22]. A partir de estos resultados, Sugerman et al. OLP llegó a la conclusión de que se caracterizó por el sesgo de citoquinas Th1 [23]. Esta conclusión no ha sido apoyado por el estudio de citoquinas Th1/Th2 en relación a OLP, uno de los indicadores directos de desequilibrio Th1/Th2.

En este pequeño estudio piloto, nuestra atención se centró en el cambio de TNF-alpha/IL-6, IL-1/IL-6, y IL-8/IL-6 proporción en los tejidos transduates (TT) de la OLP temas, uno de los medios de diagnóstico que refleja exactamente la respuesta inmune local de la cavidad oral.

2. MATERIAL Y MÉTODOS
2,1. El clinicopathological datos de los sujetos

Todos los sujetos fueron de la Universidad de Minnesota Oral Medicina Clínica y Hospital de Estomatología, Sun Yat-Sen University. Con la aprobación de la Comisión para el Uso de Sujetos Humanos en Investigación, se obtuvo el consentimiento de todas las materias.

Trece pacientes clínicamente diagnosticados como OLP [24] y 13 de edad-sexo corresponde individuos sanos fueron reclutados para el estudio. Tenían que cumplir con los siguientes criterios: (1) la ausencia de cualquier detectable gingival y / o inflamación periodontal y otros visibles lesiones orales, (2) la ausencia de la historia de los entes locales y las enfermedades sistemáticas, (3) la ausencia de registro de medicamentos Por ejemplo, los anticolinérgicos, antihistamínicos, antihipertensivos, beta-bloqueadores adrenérgicos, y otras régimen de inducción de hiposalivación, y (4) la ausencia de los anteriores o en curso de tratamiento. Sus características se enumeran en el cuadro 1.

La biopsia de cada paciente, tras la recogida de fluidos orales, y las muestras de tejidos fueron procesados por el Departamento de Patología Oral en ambas universidades. El diagnóstico anatomopatológico confirmó por dos patólogos orales con independencia era compatible con el diagnóstico clínico.

2,2. Colección de tejido Transudados

La lesión del tejido Transudados (TT) han sido recogidos por una técnica modificada [25]. En pocas palabras, la TT fue colectado después de secar un poco la OLP zona de lesión y luego de colocar una tira de Periopaper directamente sobre la zona durante 30 segundos. En el grupo control, la TT fue recogida por el mismo método en el correspondiente sitio anatómico. El volumen de TT se cuantificó en el Periotron (Harco, Tustin, Calif, EE.UU.) y las tiras de papel se coloca en 1,5 mL micropipeta tubos que contienen 1 mL de solución salina. Después de la recogida, todas las muestras fueron inmediatamente almacenados a -20 ° C hasta el momento de analizarse.

2,3. Detección de citocinas

Antes de análisis, una muestra de las tiras de papel se eluye en un 3 por centrifugación extracciones seriadas, cada una utilizando 1 mL de solución tampón PBS a 10 000 rpm durante 30 segundos, y se combinó con la solución salina que las tiras de papel se almacenan inicialmente en forma inmediata después de colección.

A continuación, todas las muestras fueron descongelados en hielo en el laboratorio y se centrifuga a 6 000 rpm durante 20 minutos. Sobrenadantes se evacue y utilizado en la prueba ELISA de citoquinas ensayos. Para cada muestra, 100 μ l sobrenadante fue utilizado para estos ensayos.

TNF-alfa, IL-1 alfa-IL-6 y IL-8 se determinaron las concentraciones de los cuantitativos técnica de ELISA sandwich tal como está descrita anteriormente [26], utilizando los kits disponibles comercialmente (R & D Systems Inc, Minneapolis, Minn, EE.UU.) con una sensibilidad de menos de 3 pg / ml. En pocas palabras, Costar de 96 pocillos EIA Las placas fueron recubiertas con un 1: 1000 dilución de 1 mg / ml anti-IgA (Dako). Las placas fueron incubadas a la noche a la mañana. Normas, muestras, en blanco y se incubaron por 2 horas. Ejemplos de diluciones osciló entre 1: 50000 a 1: 200000 y las normas van desde 0,5 a 10 ng / mL (Sigma). Biotinylated anticuerpos para cada uno de citoquinas fueron incubadas durante 2 horas. Avidina-fosfatasa alcalina conjugada (Organon Teknika, Países Bajos) se incubó durante 2 horas. Fosfatasa se añadió el sustrato y se le permitió desarrollar durante 30 minutos en la oscuridad y la reacción fue detenido con 1 mol / L NaOH . Todas las incubaciones fueron a 37 ° C. Todos los platos fueron lavados entre cada paso con PBS-Tween tampón de lavado. Se midió la absorbancia a 450 nm utilizando el software de Molecular Devices Corporation. La norma Se diagramaron las curvas en un diario de registro de escala. Muestra se determinaron las concentraciones de regresión lineal del promedio diario de la columna de absorbancia contra la concentración estándar de registro. R-squared valores típicos para el diario de registro de las curvas de calibración fueron> 0,98; columna coeficientes de variación oscilaron entre el 10% -20%. Las correlaciones entre la muestra se diluciones> 0,90.

2,4. Estadísticas

Los datos fueron expresados como media ± desviación estándar (SD). Dado que no está claro si los datos se distribuyeron normalmente, los datos de prueba de normalidad (Shapiro-Wilk test), Mann-Whitney test, e independiente de las muestras de prueba t se realizaron, respectivamente. P <.05 Se consideró estadísticamente significativo. Paquete de Estadística de Estudios Sociales (SPSS, versión 11,0, SPSS Inc, Chicago, Ill, EE.UU.) el software se utiliza para analizar los datos.

3. RESULTADOS

Todos los datos fueron confirmados a ser la distribución normal de Shapiro-Wilk test. Los mismos resultados se obtuvieron a partir de los dos no paramétrico y pruebas paramétricas. Los resultados estadísticos de muestras independientes de t test se presentan en los cuadros 2 y 3.

4. DISCUSIÓN

El balance Th1/Th2 hipótesis surgió a finales del decenio de 1980. Actualmente, gran parte de la literatura han elevado el balance Th1/Th2 concepto al nivel de paradigma, además de citoquinas y anticytokine terapias, derivado del concepto de modulación de desequilibrio Th1/Th2, se han aplicado con éxito a varias enfermedades autoinmunes [27], incluidos los Síndrome de Sjogren [28, 29], psoriasis [6], los corticosteroides y el asma resistente al [8]. Sin embargo, algunas observaciones se indica que abordar el papel de cada uno de citocinas durante la respuesta inmune puede ser mucho más informativo que utilizando la manta Th1/Th2 descriptores [2]. En OLP, una respuesta inflamatoria trastorno de la mucosa oral mediada por células T, sin embargo, varias líneas de estudios sobre las distintas citocinas introducido anteriormente no parecen capaces de esbozo general de la respuesta inmune a OLP y no dar algunas nuevas ideas sobre la estrategia de terapia OLP a fin de que la aplicación de citoquinas y las terapias a anticytokine OLP parece haber mucho camino por recorrer. Por lo tanto, es necesario investigar el posible patrón Th1/Th2 OLP en que será beneficioso para su tratamiento.

Tradicionalmente, la IL-2 e IFN-γ, IL-4 e IL-5 se clasificaron en citoquinas Th1 y citoquinas Th2, respectivamente. A medida que más y más citoquinas han sido descritas y caracterizadas, algunas citocinas que no son necesariamente secretados por las células CD4 + células T promovido el desarrollo de cualquiera de Th1 o Th2 células [2]. Por ejemplo, TNF-alfa, IL-1, e IL-8 como asociados-Th1 y citoquinas IL-6 como Th2 asociada a citoquinas han sido asignados a algunas investigaciones [30, 31]. En este estudio preliminar, TNF-alfa, IL-1, IL-8, e IL-6 fueron asignados a Th1 y citoquinas Th2, respectivamente. El nivel de TNF-alfa, IL-1-alfa, IL-6 e IL-8 en TT OLP de los pacientes y controles normales se determinó. Nuestros resultados mostraron que la concentración de TNF-alfa, IL-1-alfa, IL-6 y IL-8 fue significativamente mayor en los TT de la OLP pacientes que en el de controles, además, todos los ratios de citoquinas, TNF-alpha/IL -6, IL-1/IL-6, y IL-8/IL-6 OLP en los pacientes se redujeron significativamente, en comparación con la de los controles. Este resultado es, a nuestro entender, el primero en sugerir la presencia de una de citocinas Th2-condición dominante en estos limitado de temas OLP. Dado que los estudios anteriores se indica el sesgo de citoquinas Th1 en OLP [23], parece ser necesaria para evaluar cuidadosamente los datos publicados antes de su conclusión se hará.

En el pasado análisis de la expresión simultánea de Th1 y Th2 citoquinas, Simark-Mattsson et al. observó que las células que expresan ARNm para IL-2, IL-4, IL-10, TNF-α y TGF-beta 1 se encontraron en todas las biopsias estudiadas, y el mensaje de IFN-γ e IL-10 se detectó en el culto T-líneas celulares de todos los pacientes [9]. Fayyazi et al. puesto de manifiesto la coexpression de IFN-γ e IL-6 mRNA en la parte superior del tejido conectivo subepitelial y basal y suprabasal queratinocitos de la piel alterada / mucosa oral [13]. Khan et al. informó de que unstimulated OLP lesional células T secretada IFN-γ in vitro pero IL-4, IL-10 y TGF-beta 1 secreción no se detectaron [12]. Yamamoto et al. detectó aumento de IL-4 y TNF-alfa en el suero de aproximadamente un tercio de los pacientes, e IL-6 en todos los pacientes [11, 32], y también encontró que un mayor número de IFN-alfa, IL-6 y TNF - alfa fueron generados por la infiltración de tejido de células mononucleares (TIMCs) de la OLP, en comparación con TIMC de la inflamación crónica encía [17]. Pero estos estudios no han calculado y se comparó la proporción de citoquinas Th1/Th2, la prueba directa de equilibrio Th1/Th2, a OLP.

Del mismo modo, nuestra detección también puso de manifiesto la argumentación simultáneo de TNF-alfa, IL-1-alfa, IL-8, e IL-6 en el TT de la OLP pacientes. Sin embargo, disminuyó la proporción de citoquinas, TNF-alpha/IL-6, IL-1/IL-6, y IL-8/IL-6, se midió a los pacientes OLP. Se puede atribuirse a la razón de que el aumento de IL-6 es mucho más alcance que el de TNF-alfa, IL-1-alfa, IL-8 como se ve en la Tabla 2. Este resultado indica la posibilidad de que un Th2 dominado por la respuesta inmune que ocurre en un subgrupo de pacientes con LPO. Por otra parte, TT fue seleccionado como un medio de análisis en nuestro estudio. Con las ventajas de seguridad, mínima invasión, y de fácil acceso, varios tipos de fluidos corporales se han aplicado a una gran cantidad de citoquinas en los análisis clínicos y estudios experimentales, incluyendo el lavado broncoalveolar [33, 34], orina [35], el líquido sinovial [ 36, 37], saliva y [38, 39]. Desde una serie de citoquinas producidas en los tejidos de la OLP a través de autocrina y paracrina procesos desempeña un importante papel en la respuesta inflamatoria local de la OLP [23], la recopilación y el análisis de TT se evitará la interferencia de subclínica de lesiones inflamatorias oral-facial región. Los resultados de TT análisis puede reflejar más exactamente la situación local inmune OLP de que la lesión de toda la saliva, fluido gingival crevicular, y otros fluidos orales. Por lo tanto, nuestros resultados presentados aquí no dan la evidencia de que una de citocinas Th2-dominanted respuesta inmune existe, en algunos casos, con la OLP.

En resumen, nuestro estudio, junto con los informes anteriores, indicó que los distintos modelos de desequilibrio Th1/Th2, Th1 o Th2 overactivation o mixta Th1/Th2 condiciones, puede ocurrir en la patogénesis de la OLP. La gran escala de pacientes y más tipos de citoquinas deben incluirse en el futuro investigaciones antes de los resultados disponibles se utilizarán en la vigilancia de la actividad de la enfermedad y la orientación de la OLP terapia.

Esta obra fue financiada en parte por el Consejo Nacional de Ciencia Naturales de la Fundación China para el segundo autor (30371539), y la División de Medicina Oral de la Universidad de Minnesota al primer autor (6143901). Damos las gracias al doctor Wang Xuan y Xiaobing Chen Guanghua de la Escuela de Estomatología, Sun Yat-Sen University, China, para su análisis estadístico.