PLoS ONE, 2007; 2(4): (más artículos en esta revista)

Buscando específicas de tejido Plan de Expresión relacionado Nucleótidos de UGT1A isoformas

Biblioteca Pública de la Ciencia
Wei Zhang [1], Wanqing Liu [1], Federico Innocenti [1], J. Mark Ratain [1]
[1] Sección de Hematología / Oncología, Departamento de Medicina, Universidad de Chicago, Chicago, Illinois, Estados Unidos de América
[2] Comité de Farmacología Clínica y Farmacogenómica, la Universidad de Chicago, Chicago, Illinois, Estados Unidos de América
[3] Cancer Research Center, The University of Chicago, Chicago, Illinois, Estados Unidos de América
Resumen

UDP-1A isoformas glucuronosyltransferases pertenecen a una superfamilia de enzimas microsomiales responsable de la glucuronidación de numerosos endógenos y exógenos compuestos. Los nueve funcional UGT1A isoformas están codificadas por un solo gen locus UGT1A con múltiples primera exones. La expresión de la UGT1A transcripciones se midió cuantitativos de RT-PCR en 23 tejidos humanos normales. El tejido-específico patrones de expresión se observó en 13 tejidos. Para entender el mecanismo de regulación que se encarga de los tejidos específicos de los patrones de expresión, escaneada la secuencia de ADN de las alineaciones putativo promotor regiones, el exón 1 y secuencias intrón 1 secuencias de los patrones de expresión ligada a nucleótidos. El uso de uno de los patrones de expresión ligada a los nucleótidos de los hígados, como ejemplo, puso de manifiesto que una base de datos compuesta de estos patrones de expresión ligada a los nucleótidos pueden utilizarse para generar hipótesis se centró en el problema de tejido-específico de expresión, que es fundamental para específicas de tejido farmacodinámica de los medicamentos contra el cáncer.

Introducción

Humanos UDP-glucuronosyltransferase (UGT) 1A es una subfamilia de las enzimas que UGT glucuronidate xeno-/endobiotics y muchos otros sustratos tales como la bilirrubina y esteroides para hacer la productos metabólicos más fácilmente excretados del cuerpo a través de la orina y las vías biliares [1], [2]. Al menos 12 UGT1A isoformas se han identificado [3]. Secuencia de ácidos nucleicos análisis indica que UGT1A2, UGT1A11, y UGT1A12 codificar pseudogenes [3]. Los nueve funcional UGT1A isoformas (UGT1A1, UGT1A3, UGT1A4, UGT1A5, UGT1A6, UGT1A7, UGT1A8, UGT1A9, UGT1A10) son codificadas por un solo gen locus UGT1A primero con varios exones, localizado en el cromosoma 2q37 [4], [5]. Ubicado en el 3 'de la región centro son los exones 2-5, que codifican la conserva 245 aminoácidos de la región carboxilo. Cada exón primera está flanqueada por la polimerasa II secuencias de reconocimiento. Mientras tanto, el empalme de cada intrón encajar el imperio de la GT-AG en el exón-intrón límites. Estos sugieren que cada gen puede ser regulada por separado [4], [6].

Informes UGT1A en relación con los perfiles de expresión mRNA indican que cada tejido contiene un complemento selectiva de UGT1A productos genéticos [7]. Aunque no es ampliamente estudiado hasta la fecha, la expresión diferencial de UGT1A isoformas se ha observado en hepáticos y extrahepáticos tejidos [6], [8]. Como UGT1A genes desempeñan papeles críticos en el metabolismo de xeno-/endobiotics, sus tejidos específicos de expresión sería muy importante para los órganos y tejidos específicos de toxicidad y respuesta a la variedad de drogas. Por lo tanto, comprender el mecanismo subyacente del tejido-específico de expresión de estos genes sería esencial para la farmacogenética y la farmacodinámica de los medicamentos que se glucuronidated. Sin embargo, precisa la distribución y expresión de toda la UGT1A lugar en los tejidos humanos no han sido sistemáticamente examinado. En el presente trabajo, cuantitativa en tiempo real de reacción en cadena de polimerasa (RT-PCR) se utilizó para detectar las transcripciones de todas las de los nueve miembros funcional de la UGT1A locus en 23 tejidos humanos normales. Unique específicas de tejido patrones de expresión se observó en 13 tejidos. Desde la regulación individual de la única UGT1A transcripciones no se ha demostrado concluyentemente y suele ser difícil de probar experimentalmente, se aplicó un enfoque in silico para buscar el patrón de expresión ligada a nucleótidos. Debido a la estructura única de UGT1A locus específicos de nucleótidos en regiones promotoras, el exón 1 secuencias, las secuencias intrón 1 Mayo (conjuntamente) contribuir a la observada en tejidos específicos de los patrones de expresión. Algunos posibles mecanismos incluyen promotor eficiencia a través de factor de transcripción de carácter vinculante y alternativa o falso empalme. En concreto, se analizaron las regiones putativo promotor, el exón 1 y secuencias intrón 1 secuencias de nucleótidos asociada con un pañuelo de expresión concreta, centrándose en los once tejidos que había más de dos isoformas UGT1A expresó. La base de datos resultante de la piscina o la expresión-modelo-ligado nucleótidos entonces se podrían utilizar para generar hipótesis se centró en la regulación de los tejidos específicos de expresión de UGT1A isoformas.

Resultados y Discusión

Hemos medido los niveles de expresión de los nueve funcional UGT1A isoformas en 23 tejidos normales. UGT1A genes no se expresan en 10 tejidos (cerebro, músculo esquelético, el bazo, útero, glándula mamaria, hipófisis cuerpo, la médula ósea, los ganglios linfáticos, leucocitos y todas las fracciones de sangre), mientras que el tejido-específico patrones de expresión se observa en otros tejidos 13 , Entre los cuales la placenta y el pulmón sólo había expresado una isoforma (UGT1A6) (Tabla 1]. Algunos ejemplos de la expresión de isoformas UGT1A entre múltiples muestras de tejidos humanos se presentan en la Figura 1. La relativa expresión nivel sobre la base de la densidad de los productos PCR de las isoformas en cada tejido se muestran en la Tabla 1. Algunos publicado en tejidos específicos patrones de expresión se han confirmado en nuestra RT-PCR la expresión de datos. Por ejemplo, nuestros datos confirman que UGT1A1, UGT1A3, UGT1A4, UGT1A6 y UGT1A9 se expresan en el hígado [3], [9] - [12], UGT1A6 se expresa en los pulmones [13], UGT1A7 se expresa en los riñones [13], UGT1A10 y se expresa en los intestinos [7].

UGT1A isoformas mostró patrón de expresión específica en diferentes tejidos. Por ejemplo, en los hígados, sólo el 6 UGT1A isoformas (UGT1A1, UGT1A3, UGT1A4, UGT1A5, UGT1A6, UGT1A9) ha detectado expresión a distintos niveles. Nuestro propósito principal fue explorar un enfoque para estudiar el mecanismo responsable de la observada en tejidos específicos de los patrones de expresión. Debido a la singular estructura del grupo UGT1A, la hipótesis de que los nucleótidos que estaban vinculados a las modalidades de la expresión tal vez (en conjunto) contribuir a la regulación de la expresión en diferentes tejidos. Una base de datos o conjunto de patrones de expresión ligada a los nucleótidos se construyó mediante el escaneo de los supuestos promotores, secuencias intrón 1, así como el exón 1 secuencias de los nueve funcional UGT1A isoformas. El CLUSTAL W [14]-generado múltiples alineaciones fueron utilizados para identificar los nucleótidos concretos que tuvo el mismo patrón con la expresión en un determinado tejido. Por ejemplo, para buscar los nucleótidos que puedan estar vinculadas a la expresión de los patrones de UGT1A isoformas en el hígado, escaneados los múltiples alineaciones en los promotores (el exón 1 secuencias, las secuencias intrón 1) para los nucleótidos que eran idénticos a UGT1A1, UGT1A3, UGT1A4, UGT1A5, UGT1A6 y UGT1A9 (isoformas expresadas en el hígado, Tabla 1], pero diferentes en UGT1A7, UGT1A8 y UGT1A10 (isoformas no se expresa en el hígado, Tabla 1]. La base de datos completa incluida la original, las secuencias de nucleótidos, múltiples alineaciones y los nucleótidos identificados para cada tejido se proporcionan en los materiales suplementarios. La base de datos entonces se podrían utilizar para generar hipótesis que se centró podría ser aún más a prueba experimentalmente y / o bioinformatically.

Para mostrar un ejemplo, hemos utilizado el Match [15] programa para buscar en la base de datos TRANSFAC [16] para los posibles TFBS torno a uno de los patrones de expresión ligada a los nucleótidos de hígados. El hígado de expresión específica de nucleótidos más cercana a la SAT es una C en la 3028 ª bp en la alineación múltiple de 3447 bp de los promotores putativo de las seis isoformas UGT1A con expresión hepática y, o bien una laguna o una G para las tres isoformas UGT1A no se expresa en el hígado (ver material complementario). El Match identificado un programa de TFBS AP-1 (activador de proteínas 1) para tres de los seis hígado-expresó UGT1A isoformas (UGT1A3, UGT1A4, UGT1A5). Una hipótesis comprobables entonces podría ser que el sitio de unión de AP-1 cerca de la SAT puede estar contribuyendo a la expresión en el hígado de estas tres isoformas, pero no los otros tres-expresó el hígado isoformas. Por supuesto, esta gama no significa necesariamente que este factor de transcripción es el único factor determinante para la expresión hepática. El ejemplo sólo mostró que ahora puede utilizar la base de datos para priorizar nuestros esfuerzos y orientar los nuevos estudios sobre la base de estos nucleótidos. Además de promotor de eficiencia, otros mecanismos como splicing alternativo puede contribuir también a la observada en tejidos específicos de los patrones de expresión. Para generar este tipo se centró hipótesis, podríamos buscar en el tejido-específico de nucleótidos en nuestra base de datos para posibles exonic o potenciadores intronic empalme [17], [18]. Por lo tanto, la identificación de estos patrones de expresión vinculada nucleótidos en diferentes tejidos siempre potenciales objetivos de trabajo, tanto experimental y / o bioinformatically, para la realización de pruebas y la generación de hipótesis se centró en los mecanismos responsables de los tejidos específicos de expresión de UGT1A isoformas.

Notas a pie de página

Los materiales suplementarios se puede acceder a http://home.uchicago.edu/ ~ Wzhang1/PONE/UGT1A/and serán depositados en PharmGKB ( http://www.PharmGKB.org ).

Materiales y Métodos
Humanos muestras de tejidos normales

ADN complementario (ADNc) de un total de 23 tejidos humanos normales fue adquirido de Clontech (Clontech Laboratories, Inc, Palo Alto, CA, EE.UU.). Estos incluyen los tejidos del cerebro humano, placenta, músculo esquelético, riñón, páncreas, bazo, timo, próstata, testículo, ovario, intestino delgado, útero, glándula mamaria, tiroides, hipófisis cuerpo, la médula ósea, vejiga, las amígdalas, los ganglios linfáticos, leucocitos, fracciones de sangre, el hígado y el pulmón.

Expresión de UGT1A isoformas en tejidos normales

La expresión de la UGT1A transcripciones se midió en los 23 tejidos humanos normales de PCR usando TITANIUM Taq ADN polimerasa (Clontech). En pocas palabras, la PCR fue creado en un 50 μ l con reacción vol 3 μ l de cDNA como plantilla. Primers para cada exón 1 se 5'-aacaaggagctcatggcctcc-3 '(UGT1A1), 5'-tgttgaacaatatgtctttggtcta-3' (UGT1A3), 5'-gaaggaatttgatcgcgttac-3 '(UGT1A4), 5'-ggtggtggtcctcaccctg-3' (UGT1A5), 5'-cagctgtcctcaagagagatgtgga-3 '(UGT1A6), 5'-gttgcgaactgactttgttttggag-3' (UGT1A7), 5'-ggtcttcgccaggggaatagg-3 '(UGT1A8), 5'-ttctccaaacacctgttacggag-3' (UGT1A9), 5'-cctctttcctatgtccccaatga-3 '(UGT1A10). En el reverso primer (5'-ccaatgaagaccatgttgggc-3 ') fue compartida por todos los UGT1A genes. Reacciones de PCR fueron desnaturalizados inicialmente a 95 ° C durante 1 minuto, y luego a ciclos 35 veces a 95 ° C durante 30 años, recocido y la extensión a 65 ° C durante 3 min. GAPDH gen se amplificó con la mismas condiciones que el anterior mediante el uso de primers 5'-tgaaggtcggagtcaacggatttggt-3 'y 5'-catgtgggccatgaggtccaccac-3' y sirvió como un control interno de cDNA cantidad y calidad.

Las secuencias de ADN de UGT1A isoformas

El GenBank / NCBI secuencia de referencia para la UDP-glucuronosyltransferase 1 familia, polipéptido Un grupo en el cromosoma 2 (NG_002601) se utilizó para recuperar las siguientes regiones para la UGT1A isoformas.

Identificación de patrones de expresión ligada a los nucleótidos

Las secuencias de nucleótidos de la UGT1A isoformas fueron alineados utilizando CLUSTAL W [14] (configuración por defecto) en el Instituto Europeo de Bioinformática sitio web ( http://www.ebi.ac.uk/clustalw/ ). Las alineaciones y las secuencias de ADN original se proporcionan en los materiales suplementarios. Las múltiples alineaciones fueron escaneados para los nucleótidos que estaban vinculados a un determinado patrón de expresión de cada isoforma y cada tipo de tejido. Por lo tanto, la expresión-modelo-nucleótidos son vinculados en la forma de un vector ordenado N = t [n 1 (p 1), n 2 (p 2),… n j (p j)], donde N t representa el vector específicas de nucleótidos para la obtención de tejidos t, n es un nucleótido, p es un número entero de la posición en una alineación. Los elementos de N son t [n j (p j): ψ (p j)], donde ψ representa el conjunto de nucleótidos conservados de UGT1A isoformas con expresión en un determinado tejido en una posición p. Los nucleótidos identificados y sus sitios de acompañamiento (25 pb aguas arriba / aguas abajo) fueron de salida como entradas de la base de datos.

Predicción del factor de transcripción de sitios de unión utilizando Match

Para mostrar un ejemplo de que la base de datos compuesta de expresión-modelo-ligado nucleótidos se podrían utilizar para generar hipótesis se centró en tejidos específicos de expresión, hemos utilizado el Match [15] programa en el Reglamento Gene sitio web ( http://www.gene-regulation.com/ ) Para predecir el factor de transcripción sitios de unión (TFBS) en las regiones que contienen una de las hígado específicas de nucleótidos. Match El programa busca la base de datos TRANSFAC [16] para los posibles TFBS (básicos de corte = 0,95, matriz de corte = 0,90) utilizando la base de datos de alta calidad para los vertebrados [15]. Los resultados de la búsqueda (TFBS) que cubran los patrones de expresión ligado al de nucleótidos fueron comparados con los patrones de expresión de las isoformas UGT1A.