Journal of Molecular Signaling, 2007; 2: 3-3 (más artículos en esta revista)

E2F8 es un nonreceptor activador de proteínas heterotrimeric G

BioMed Central
Ian S Hagemann (hagemani@wustl.edu) [1], Kirk D Narzinski (knarzins@wustl.edu) [1], Thomas J Baranski (baranski@wustl.edu) [1]
[1] Departamentos de Medicina y de Biología Molecular y Farmacología, 660 S. Euclid Ave., Campus Box 8127, St Louis, Missouri 63110, EE.UU.

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Resumen
Fondo

Heterotrimeric G proteínas son importantes para numerosos eventos de señalización en eucariotas, que actúa principalmente a transduce señales que se inició por la proteína G-receptores acoplados. Recientemente ha quedado claro que nonreceptor activadores puede regular el nivel de heterotrimeric G proteína de señalización y, en algunos casos, conducir ciclos de receptor-proteína G independientes de activación. En este estudio, hemos utilizado una levadura expresión clonación estrategia para identificar nuevos nonreceptor activadores de heterotrimeric G proteínas humanas en una biblioteca de cDNA adipocito.

Resultados

El factor humano de transcripción E2F8 se encontró heterotrimeric para activar las proteínas G, lo que sugiere un papel biológico de esta descrito recientemente miembro de la familia E2F. Epistasis estudios demostraron que E2F8 actuado a nivel de las proteínas G y fue específica para G α i Gpa1 más. E2F8 aumentada del receptor de señalización impulsados, sino también activar las proteínas G en ausencia de un receptor. El GTPase-activando la proteína RGS4 antagoniza el efecto de E2F8, lo que demuestra que el efecto E2F8 en G α participan nucleótidos volumen de negocios. Toda la proteína E2F8 era necesaria para la plena actividad, pero la mayoría de la actividad de señalización parece residir en los primeros 200 residuos.

Conclusión

En la levadura, E2F8 es un nucleótido guanina factor de cambio (FMAM) para la subunidad α de las proteínas G heterotrimeric. El mecanismo molecular y la importancia biológica de este efecto, no se habían determinado.

Fondo

Células uso heterotrimeric G proteínas transduce a una amplia variedad de señales, incluyendo las hormonas polipeptídicas, pequeñas moléculas, olores, y la luz. Se trata, por tanto, uno de los principales medios por los cuales las células reunir información sobre su medio ambiente [1]. En el paradigma convencional de la proteína G de señalización, un ligando de la proteína G activa-junto receptor (GPCR) se encarga de catalizar el intercambio de GTP para el PIB en el heterotrimer la subunidad α. Este intercambio se traduce en la disociación de la heterotrimer, liberando la α y βγ fracciones de ejercer celular y el contexto que dependen de efectos aguas abajo. Por lo general, se ha pensado que los receptores activados son la principal fuente de nucleótidos de guanina factor de cambio (FMAM) para la actividad heterotrimeric G proteínas. Sin embargo, en los últimos años se ha puesto de manifiesto que varios nonreceptor GEFs también existen, proporcionando las células con un nuevo nivel de control sobre la actividad de la proteína G.

Uno de los primeros nonreceptor GEFs para ser identificado fue GAP-43, también conocido como B-50 o neuromodulin. GAP-43 es abundante en las neuronas y los conos de crecimiento axonal pathfinding promueve durante el desarrollo y la regeneración [2]. La investigación de la función de GAP-43, Fishman y compañeros de trabajo encontraron que había actividad del FMAM hacia α o G, otra proteína que es abundante en los conos de crecimiento, y que esta actividad era sinérgica con la de los receptores [3 - 8].

Más recientemente, una serie de documentos ha descrito una diversa colección de "activadores de la proteína G de señalización" (AGS proteínas). AGS1 tiene la actividad intrínseca del FMAM [9, 10], y el mecanismo de esta actividad parece ser análoga a la del FMAM actividad de los receptores, los receptores y desde AGS1 puede competir por heterotrimers [11]. AGS2-8 activar la proteína G de señalización en la levadura, pero parece hacerlo por perturbar heterotrimers en lugar de estimular el intercambio de nucleótidos G α [12].

El papel biológico de nonreceptor GEFs se ha dilucidado sólo mínimamente, pero una reciente serie de experimentos ha definido una función de una de estas moléculas en un determinado contexto de desarrollo. Ric-8A/synembryn es un nonreceptor FMAM con especificidad para o G, G i, G y q [13]. C. elegans cigotos someterse a una primera división asimétrica que requiere Ric-8 para el correcto posicionamiento del aparato mitótico [14 - 16]. Ric-8 parece ser el FMAM que conduzca un receptor independiente de ciclo de GTP vinculante y la hidrólisis, en el que cada iteración del ciclo incremental recoloca el huso mitótico [17].

En el curso de una pantalla de novela nonreceptor activadores de las proteínas G, hemos encontrado que E2F8 humanos promueve el intercambio de nucleótidos G subunidades α. Este hallazgo fue inesperado, ya que E2Fs han sido previamente consideradas como factores de transcripción en primer lugar, los moduladores de la apoptosis, los reclutadores y la remodelación de la cromatina complejos. Aquí, vamos a presentar pruebas de que las funciones de E2F8 incluyen el aumento de heterotrimeric G proteína de señalización, por lo tanto, potencialmente enlazando dos vías de señalización que hasta ahora han sido consideradas por separado.

Resultados
E2F8 se activa selectivamente G α i en la levadura
Estructura y funciones de análisis E2F8

E2F8 la capacidad de activar las proteínas G fue muy sorprendente, ya que esta sería una nueva función para un miembro de la familia E2F. Se examinó la secuencia de E2F8 para identificar cualquier motivos que podría arrojar luz sobre el comportamiento que hemos detectado. La estructura primaria de E2F8 contiene dos E2F ADN vinculante de dominio en las posiciones 112-182 y 260-357; cada una de estas regiones incluyen la canónica RR X YD motivo que interactúa directamente con el ADN [29] (Figura 3]. El resto de las regiones de E2F8 exhibió un mínimo de similitud con otras proteínas conocidas, según lo determinado por la búsqueda BLAST [30].

A la luz de E2F8 la sorprendente capacidad de activar las proteínas G, se pregunta si es similar a otras proteínas conocidas con esta función. E2F8 carece de la proteína G reguladora (GPR), secuencia que aparece para definir el G α-PIB-AGS estabilizar las proteínas [31]. Curiosamente, encontramos que E2F8 contiene una extensa región de homología a GAP-43, un conocido nonreceptor FMAM: residuos entre 400 y 630, E2F8 fue de 27% similar a GAP-43 y el 16% idénticos. Por otra parte, la homología de dominio no incluye los primeros diez aminoácidos de GAP-43. Estos residuos de GAP-43 son suficientes para activar o G, aunque con baja potencia [7].

Hemos construido una serie de E2F8 truncamiento y supresión mutantes para identificar regiones de la proteína que se requiere para la función. Los mutantes se fusionaron para YFP para permitir la expresión para ser verificados. Truncamiento de los primeros 200 aminoácidos de E2F8 eliminado su capacidad de activar las proteínas G (Figura 4A], lo que sugiere que el N-terminal de dominio es necesario para la actividad. De acuerdo con esta hipótesis, E2F8 residuos 1-401 eran suficientes para activar la vía reportero, aunque lo hicieron menos fuerte que el de larga duración de proteínas. Curiosamente, el E2F8: (1-602)-YFP construir no fue capaz de activar las proteínas G. El truncamiento puede, en este caso han dado lugar a misfolding, 402-602 o residuos pueden tener autoinhibitory funciones. Dos E2F8 construcciones en las que el GAP-43 homología dominio fue completamente (Δ E2F8 (399-630) - YFP) o parcialmente (Δ E2F8 (399-500) - YFP) suprimida mantiene la capacidad de señalización, lo que sugiere que la capacidad de activar G proteínas no residen en este ámbito. Dado que ninguno de los mutantes había plena actividad, parece que toda la proteína es necesaria para silvestres de tipo de señalización en este sistema, pero que la mayoría de la actividad residía en la N-terminal región.

La variable de señalización de E2F8 mutantes no reflejan simplemente el fracaso de algunos mutantes que se expresa en la levadura. Todos los YFP de etiquetado mutantes de levadura resultó en fluorescencia, argumentando que las proteínas se expresaron (Figura 4A]. La mayoría de los mutantes podrían ser detectados por inmunotransferencia, pero su aparente niveles eran muy variable, lo que refleja bien la variable expresión, la degradación de las proteínas durante la lisis de levadura, o insuficiente sensibilidad de nuestra técnica (Figura 4B]. Hubo, sin embargo, ninguna correlación entre la fuerza de señalización y detección de la proteína de inmunoblot. E2F8-YFP, que señaló con firmeza, se detectó sólo ligeramente, mientras que E2F8: (1-602)-YFP, que no marcó, fue detectado con firmeza.

Es importante destacar que todas las construcciones que no se detectó señal de, al menos, débilmente por inmunoblot, lo que demuestra que fueron expresadas-sobre todo porque estos contructs también dictó levadura fluorescente. No podemos, sin embargo, excluir la posibilidad de que los diferentes niveles de expresión contribuido en cierta medida a los diferentes fenotipos que hemos detectado con los mutantes.

Discusión

Hemos identificado el factor de transcripción E2F8 en el curso de una pantalla para nuevos activadores de heterotrimeric G proteínas. En S. cerevisiae, E2F8 fue capaz de activar una proteína G / MAP kinasa reportero vía; esta actividad era específica para la proteína G particular isoformas, mapas epistatically al nivel de heterotrimers, y se antagoniza por una aceleración de GTPase-proteína. El amino-terminal de la proteína parece ser más importante para la activación de proteína G. La mayoría de parsimonious interpretación de estos resultados es que E2F8 estimula el intercambio de nucleótidos en la subunidad α de las proteínas G heterotrimeric. Desde E2F8 no redujo la máxima mediada por los receptores de señal (Figura 2], sino más bien provocó un cambio de izquierda en el receptor de la curva dosis-respuesta, E2F8 no compite con los receptores de las proteínas G. En lugar de ello, E2F8 y los receptores pueden ser complementarias entre sí en su modo de acción, utilizando diferentes mecanismos moleculares para activar G α.

La activación de proteína G sería una novela función de un factor de transcripción E2F. La familia E2F de factores de transcripción ha sido clásicamente asociada a la célula del ciclo de regulación y la diferenciación celular [32, 33]. La "activación" de subgrupos, E2F1-3, se compone de proteínas que están obligados por PRB, la fracción E2F es liberado para servir como un factor de transcripción cuando se PRB fosforilados de ciclina / CDK complejos. E2F4 y 5 también se unen a las proteínas de bolsillo (PRB, p107 y p130), sino que actúan principalmente en la represión de los genes E2F objetivo de los promotores de ocupación y la remodelación de la cromatina, lo que permite mantener a las células G0 detención. E2F6 carece de la transactivation relacionados con el bolsillo y proteína vinculante dominios de E2F1-5, pero parece tener funciones similares a las otras represivas E2Fs [32, 34]. E2F1-6 obligar a todos los ADN de manera más eficiente como un E2F/DP heterodimer [35].

E2F8 la aparente capacidad para activar las proteínas G puede dar cuenta de su haber surgido en el transcurso de la evolución. Aunque ambos E2F7 y E2F8 Se ha demostrado que reprimir un subconjunto de E2F-genes regulados y reducir la proliferación celular, no función especial todavía no se ha demostrado por ellos. Puede ser significativo el hecho de que las nuevas E2Fs son estructuralmente distintos a los descritos anteriormente y bien caracterizada E2F1-6; a diferencia de estos, tanto E2F8 y E2F7 falta una AD dimerización de dominio y puede obligar al ADN de manera eficiente en ausencia de DP [22 - 24 , 36 - 38]. A este respecto, son similares a las proteínas de Arabidopsis E2L1-3 [39].

Por otra parte, carecen de una bolsa de dominio de interacción de proteínas y, por tanto, es poco probable que interactuar con PRB, p107, p130 o. En la levadura, nos dimos cuenta de que murino E2F7 no activar las proteínas G, pero no hemos podido comprobar que la proteína se expresó (datos no presentados).

Es curioso, pero no inconcebible, que un factor de transcripción también debe activar heterotrimeric G proteínas. Cell-receptores de superficie son el principal medio por el cual las células adquirir información sobre su medio ambiente hormonal, hormonal y estas señales con frecuencia desencadenan cascadas de señalización que culminan en una respuesta transcripcional. Muchas de estas cascadas de uso heterotrimeric G proteínas de señalización como un intermedio, y la integración de la proteína G con la regulación transcripcional actividad puede ser importante para la coordinación de los complejos procesos celulares. Por ejemplo, las proteínas Tubby, cuya pérdida provoca la obesidad y la degeneración retiniana en ratones [40], es un regulador transcripcional y un efector de G q señalización.

Como un posible modelo de E2F8 función, podría darse el caso de que E2F8 sirve para establecer un nivel basal de la proteína G actividad que se modulada por la actividad del receptor. El nivel de actividad de E2F8 a las proteínas G podría ser controlado mediante la redistribución de E2F8 entre el núcleo y el citosol. Desde E2F8 tiene tres secuencias de localización nuclear (NLSes) [22] y tiene efectos transcripcional, que presumiblemente se localiza en el núcleo en algún momento, pero también debe ser a veces situadas en otros compartimentos si es para tener efectos sobre las proteínas G heterotrimeric . También es posible, en un segundo modelo, que E2F8 participa en un receptor-dependiente de la activación de proteína G caso, aunque los receptores no eran necesarias para la actividad E2F8 en el sistema de levadura. E2F8 podría facilitar receptor estimulado la activación de proteína G, someterán a continuación a relocalization al núcleo para ejercer efectos transcripcional. Así E2F8 sería el agente y el objeto de una señalización caso, y una célula del receptor de la superficie podría tener una influencia directa relativamente en la transcripción E2F-de genes de respuesta. Todavía no tenemos datos suficientes para concluyente prueba estos modelos.

No se sabe si el observado actividad de E2F8 es fisiológicamente importante en células de mamífero, a diferencia de la levadura sistema heterólogo. El crecimiento de la levadura de ensayo se ha descrito en numerosas ocasiones en la literatura, incluso en estudios previos de nonreceptor activadores de la proteína G, como el AGS proteínas [9]. Sin embargo, no podemos excluir la posibilidad de que el E2F8 / G interacción de proteínas puede reflejar algunos inesperada característica de la levadura. La levadura de cascada de proteínas G difiere de la canónica de mamíferos en cascada que el libre G βγ es la fracción activa de señalización. La epistasis y la proteína G especificidad datos presentados aquí, sin embargo, parecen descartar una relación directa transcripcional de E2F8 papel en la levadura (como E2F8 upregulation de G β). Por otra parte, una proteína humana E2F (E2F1) se había encontrado a ser incapaz de obligar a S. cerevisiae ADN genómico [41], argumentando una vez más contra los efectos transcripcional.

Numerosos experimentos futuros se necesitan para caracterizar con más detalle el papel de E2F8 a la proteína G de activación y señalización celular. Los datos actuales son esencialmente de naturaleza genética y se vería reforzada por las pruebas bioquímicas complementarias. Los estudios in vitro con E2F8 purificado y subunidades de proteínas G permitiría a la hipótesis de un efecto directo de la prueba y permitiría a la proteína G especificidad como para ser más a fondo determinado. G-proteína E2F8 vinculante estudios también muestran más concluyente si una interacción física puede ocurrir. Más esfuerzo debe dedicarse a determinar si E2F7 o la planta E2Fs también interactuar con las proteínas G, ya que esta actividad no puede limitarse a E2F8.

Por último, la influencia de E2F8 a las proteínas G se identificó en la levadura, pero esa interacción debe ser estudiado junto a un fisiológicamente más relevantes del sistema. Un obstáculo a los estudios en el cultivo de tejidos de mamíferos es que parece E2F8 causa del ciclo celular detención cuando overexpressed [22 - 24]. Del mismo modo, en nuestros esfuerzos por hacer transfectadas establemente líneas de células de mamíferos, E2F8 se perdió en unos pocos pasajes (datos no presentados). Un sistema de expresión inducible podría ser una solución útil, pero sería igualmente valiosa para investigar el papel de E2F8 en un sistema donde nativa juega un papel biológico demostrable. Teniendo en cuenta que E2F8 fue clonado a partir de la madurez humana adipocito biblioteca de cDNA, el tejido adiposo parece ser un interesante punto de partida para este esfuerzo.

Conclusión

En la levadura, E2F8 sirvió como un fuerte activador de intercambio de nucleótidos en el G subunidad α de las proteínas G heterotrimeric. El efecto fue inhibido por coexpression de RGS4, parecía que se produzca directamente en el nivel de las proteínas G, y se deriva principalmente de los residuos 1-200 de E2F8. Futuros estudios son necesarios para determinar si este efecto es importante en vivo y para delinear su mecanismo molecular.

Métodos
Cepas de levadura

BY1142 cepa de levadura ha genotipo MAT α far1 Δ 1442 tbt1-1 P-1 FUS HIS3 ste14:: trp1:: LYS2 ste3 Δ 1156 G α i3, Gpa1 (1-41) his3 leu2 lys2 trp1 ura3 can1 ade2. Levadura BY1173 ha genotipo Mata his3 leu2 trp1 ura3 can1 gpa1:: ade2:: 3 × HA far1:: ura3 fus1:: P 1-FUS HIS3 LEU2:: P 1-FUS lacZ sst2:: ura3 ste2:: G418 R trp1: : GPA1 DCGLF. Cepas de levadura con las supresiones de STE4 (BY1187), STE11 (BY1206), o STE12 (BY1207) se obtuvieron a partir de BY1142 de sustitución de genes en nuestro laboratorio. La levadura se transformaron por el procedimiento de acetato de litio o de electroporación y se cultiva en medios selectivos a 30 ° C. Fluorescencia de colonias de levadura se determinó mediante el examen de ellos a 500 × magnificación en una Olympus SZX12 microscopio de disección con un arco de mercurio-fuente de luz (Hitschfel Instruments) y YFP o GFP filtro set (Olympus).

Plásmidos y la clonación

El adipocito humano biblioteca (regalo de Robin Weinberg, Pharmacia Corp.) Consistió en adipocito maduro cDNA humano clonado en vector pBN975 bajo la ADH promotor con ADE2 selección. La biblioteca consta de aproximadamente 3 × 10 6 clones. Cuando no seleccionado 24 clones fueron analizados, 22 contenían un cDNA insertado, con tamaño promedio de insertar 1200 bp; los insertos osciló en tamaño de 500 pb a 3000 bp. El plásmido codificación RGS4 fusionado a la proteína verde fluorescente (GFP) fue un regalo de Maurine Linder (Departamento de Biología Celular y Fisiología, Universidad de Washington). El constitutivamente activa NQ mutante del receptor de C5a se ha descrito anteriormente [25].

El E2F8-YFP plásmido fue construido por recombinación homóloga en levaduras. La reacción en cadena de polimerasa (PCR) se utilizó para construir un fragmento de ADN que contiene la secuencia de YFP con un 5 'brazo de homología a E2F8 y un 3' brazo de homología a la biblioteca de vectores. Estas inserciones se transformaron en BY1142 levadura junto con una doble matriz de vectores de corte en una proporción molar 1:1. Se construye a partir de levaduras aisladas de plásmido de rescate y verificadas por la secuencia (de proteínas y de Ácido Nucleico Laboratorio de Química, Washington University School of Medicine).

E2F8 mutantes fueron también construidas por recombinación homóloga en levaduras. En todos los casos, un E2F8 insertar con 5 'ADH promotor de homología y 3' YFP homología se recombinada en un doble corte YFP vector. Por el truncations, la PCR fue utilizado para sintetizar las inserciones que contiene el E2F8. Recombinación se realizó tal como se describe más arriba. La supresión se construyeron mutantes de un plan en dos etapas PCR estrategia. En el primer paso, los productos PCR de codificación E2F8 (1-398) y E2F8 (630-867), o E2F8 (1-398) y E2F8 (501-867), fueron amplificados con armas de homología con el vector y el uno al otro . En la segunda etapa, estos productos se utilizan como plantillas para una superposición de extensión reacción de PCR. La larga duración productos PCR fueron utilizadas para recombinación homóloga, tal como se describe más arriba.

Biblioteca de cribado

El adipocito humano se proyectó la biblioteca de la levadura de crecimiento de ensayo (que se describe más adelante) para identificar cDNAs que activan la proteína G / MAP kinasa apareamiento cascada. Un total de 1,7 × 10 6 transformantes fueron seleccionados. cDNAs confiere crecimiento fueron aislados por el plásmido de rescate y retransformed en levadura para reconfirmar el fenotipo. Confirmado positivos fueron secuenciados.

G ensayos de proteína de señalización en la levadura

Para el ensayo de crecimiento, las colonias de levaduras seleccionadas se estrías en una placa de maestro (Ura - Ade -), luego réplica chapada en placas selectivas (Ura - Su - Ade 1 mM) que contengan concentraciones crecientes de 3-AT (Sigma). La mínima concentración de adenina en las placas selectivo pusieron a nuestra disposición selección de colores para garantizar que la señalización se plásmido dependientes: si un reportero vía mutación surgió - permitiendo el plásmido independiente de crecimiento - y la ADE2 plásmido se perdió, levadura creció aún en mínima adenina medio, pero desarrolló un color rojo que permitía esas colonias que deben excluirse de la consideración [42].

Para β-galactosidasa ensayos, la levadura se cultiva la cultura en estado líquido y sin semillas en placas microtiter (Costar) a un OD 600 de 0,015 unidades / cm. La pequeña molécula W5Cha [43] se utilizó como un agonista. Después de un período de cuatro horas de incubación a 30 ° C en presencia de ligando, una lisis / sustrato de amortiguación se ha añadido (composición final del 0,5% Tritón X-100, 1 mg / ml clorofenoles rojo β -- d - galactopyranoside, 25 mM TUBOS, pH 6,8) y el color se permitió el desarrollo de proceder durante quince horas, luego se detuvo por adición de Na 2 CO 3 a 0,2 M. de color se evaluó midiendo O D 570 en un Bio-Rad lector de placas, modelo 680.

Immunoblotting

Para estudios de levadura, la levadura se cultiva la noche a la mañana en medios selectivos a un OD 600 de 1,5 unidades / cm. Las células fueron cosechadas a partir del 1 ml de la cultura y zadas por agitación a temperatura ambiente durante 5 min con 100 μ l de ácido-lavado bolas (0,5 mm de diámetro) y 150 μ l de 1 × SDS muestra una solución tampón que contiene PMSF (100 μ g / ml ) Y la aprotinina, leupeptina, y pepstatin (todos los 1 μ g / ml). A 1 min centrifugación (1000 × g) se utilizó para aclarar el lisado, y el sobrenadante se utilizó para inmunotransferencia.

Por immunoblots, proteínas fueron separadas por SDS-PAGE y transferidos a PVDF utilizando un aparato de transferencia húmedo (Bio-Rad). Membranas fueron bloqueadas con leche del 5% en buffer fosfato salino-con el 0,1% de Tween-20 durante 1 hora, luego probaron con primaria y secundaria de anticuerpos. Rabbit anti-GFP de anticuerpos (Santa Cruz) fue utilizado en la dilución 1:200 y el ratón anti-β-actina (ab8224, Abcam) a 1:800. Secundaria anticuerpos fueron de cabra anti-conejo o cabra anti-ratón peroxidasa de rábano conjugados (Santa Cruz) a la dilución 1:10000. Un sustrato quimioluminiscente (Lumi-Light Plus, Roche) se aplicó durante cinco minutos, y la señal se registró FluorChem utilizando un sistema de detección de 8900 (Alpha INNOTECH Corp).

Declaración de intereses

Los autores declaran que no tienen intereses en competencia.

Autores de las contribuciones

TJB proporcionado una dirección y apoyo financiero. Los experimentos fueron diseñados por los tres autores y se lleva a cabo por KDN y ISH. ISH escribió el manuscrito, que todos los autores leído y aprobado.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por el NIH R01 GM63720 (TJB) y una Asociación Americana del Corazón beca predoctoral (ISH). Damos las gracias a Robin Weinberg (Pharmacia Corp) para el adipocito humano biblioteca, Marissa Matsumoto en nuestro laboratorio para el asesoramiento, y Maurine Linder (Universidad de Washington) para la RGS4-GFP plásmido.