Journal of Immune Based Therapies and Vaccines, 2007; 5: 5-5 (más artículos en esta revista)

IMP321 (escoria-3), un immunopotentiator para las respuestas de células T contra un antígeno HBsAg en adultos sanos: un solo ciego controlados aleatorios de fase I de estudio

BioMed Central
Chrystelle Brignone (cbrignone@immutep.com) [1], Caroline Grygar (clallouet@immutep.com) [1], Manon Marcu (mmarcu@immutep.com) [1], Gaëlle Perrin (gperrin@immutep.com) [1 ], Frédéric Triebel (ftriebel@immutep.com) [1]
[1] Immutep SA, Parc Club Orsay, 2 rue Jean Rostand 91893, Orsay, Francia

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Resumen
Fondo

GAL-3 (CD223) es una alta afinidad natural ligando de MHC clase II. La forma soluble (escoria-3) induce la maduración de los monocitos a las células dendríticas derivadas in vitro y se utiliza como un potente Th1-como potenciador inmunitario con muchos antígenos en modelos animales. Para extender esta observación a los derechos humanos, una prueba de concepto estudio se realizó con un grado clínico-escoria-3, denominado IMP321, coinjected con alumbre-no absorbe recombinante contra la hepatitis B antígeno de superficie.

Métodos

En un ensayo aleatorizado, simple ciego controlado la fase I de dosis escalada estudio, 48 voluntarios sanos seronegativos de edad 18-55 años fueron vacunados en 0, 4 y 8 semanas por vía subcutánea con 10 μ g de HBsAg se mezcla con solución salina (control) o con IMP321 a un de cuatro dosis (3, 10, 30 y 100 μ g). Para evaluar la eficacia de este tres inyecciones más de 2 meses de inmunización de protocolo, un nuevo grupo control se les inyectó la vacuna comercial Engerix-B ®.

Resultados

IMP321 fue muy bien tolerado. De hecho, una menor incidencia de eventos adversos se informó desde el HBsAg IMP321 grupos más que de la Engerix-B ®. HBsAg-las respuestas de anticuerpos específicos (anti-HBs) apareció antes y fueron superiores a las 8 y 12 semanas en IMP321 receptores HBsAg en comparación con los sujetos control. Más importante aún, el aumento del número de respondedores a HBsAg se encontraron en IMP321 receptores HBsAg grupo de comparación, tal como revelan los más altos después de la vacunación de las frecuencias de CD4 Th1 o CD8 TC1 de antígenos de células T específicas. IMP321 inducida por el antígeno CD4 Th1 específica de las células T en algunos de estos individuos ingenuos, después de sólo una inyección, especialmente en los 10 y 30 μ g dosis grupos.

Conclusión

IMP321 como coadyuvante de los HBsAg fue bien tolerada y una mayor respuesta de células T inmunogenicidad de vacunas (es decir, inducida tanto CD4 Th1 y CD8 TC1 antígeno específico de células T). Esta última propiedad ha permitido el desarrollo de IMP321 como immunopotentiator de vacunas terapéuticas.

Fondo

Cuadro clínico de vacunas terapéuticas eficaces para luchar contra los virus o tumor requiere la generación y la expansión de determinados linfocitos T citotóxicos (CTL) capaces de proliferar y / o secreción de tipo Th1, tales como citocinas IL-2, IFN γ o TNF-α después de antígeno específico de estimulación . Desde algunos años, muchos esfuerzos se han realizado para tratar de amplificar la respuesta inmune y al cambio hacia una respuesta adecuada utilización de adyuvantes. Casi todas las vacunas terapéuticas adyuvantes enfoques para el uso de ligandos uno de los Los receptores tipo Toll (TLR) expresó en DC. El más estudiado de los TLR ligandos son la TLR9 ligandos deoxycytidyl-deoxyguanosin oligodeoxynucleotides (CPG ODNs) immunostimulatory o secuencias de ADN (ISS) que son potentes inductores de la inflamación ( "señales de peligro").

Además de los TLR agonistas que son ligandos inmunidad innata, la respuesta inmune implica dos inmunidad adaptativa ligandos que se expresan en células T activadas y no se unen a los receptores TLR-expresado en DC. Estos son los CD40L y la activación de genes de linfocitos-3 (GAL-3 o CD223) proteínas humanas. Formas solubles han sido probados en la investigación preclínica y / o clínico de vacunas como adyuvantes inmunológicos. Desarrollo clínico de CD40L soluble (sCD40L) se ha visto dificultada por un aumento del riesgo de trombosis debido a la activación plaquetaria directa de sCD40L [1]. Soluble GAL-3 (escoria-3) se une a MHC de clase II y moléculas induce a las células dendríticas (DC) para madurar y migrar a los órganos linfoides secundarios, donde pueden prime ingenuo-helper CD4 y CD8 de las células T citotóxicas [2 - 4], conducen a tumor rechazo [5 - 7]. Este efecto de maduración se obtiene específicamente con escoria-3 pero no con toda la prueba de MHC clase II mAbs [3], y depende de la especificidad vinculante de escoria-3 a MHC de clase II situado en las moléculas de lípidos de membrana balsa microdomains [8] . Por último, la actividad de immunostimulatory escoria-3 en la inducción de tumores humanos-asociados-antígeno específico CD8 + T cell respuestas a una mucha mayor medida que CpG ODN [9] Se ha informado recientemente [10], porque fomentan la utilización de esta proteína recombinante como un prometedor candidato adyuvante para el cáncer de vacunación.

En el presente estudio, informe sobre la clínica y los efectos biológicos, y la evaluación de la inocuidad de IMP321, un grado GMP-escoria-3 (hLAG-3Ig) de proteínas, en un gran único ciego aleatorizado fase I de ensayos clínicos. Los resultados de esta prueba de concepto estudio clínico en voluntarios sanos utilizando HBsAg como un modelo de antígenos ha allanado el camino para el desarrollo de esta proteína humana como un immunopotentiator de vacunas terapéuticas.

Métodos
Diseño del estudio y selección de materia

Este único ciego controlados estudio en la fase I se llevó a cabo en el Aster, SA Cephac instalación en París. Revisión Ética de la aprobación de la Junta se obtuvo de cada paciente y siempre voluntario consentimiento informado. Subvencionables los sujetos fueron adultos sanos la vacuna contra el VHB ingenuos voluntarios, con edades entre 18-55, sin evidencia serológica de resolver con anterioridad o en curso la infección por VHB. Sin embargo, tres de ellos fueron encontrados más tarde a ser seroconvirtieron (pero no seroprotegidos) en la línea de base en el estudio posterior determinación de anticuerpos HBsAg (# 019 sujetos, 035 y 044). Otros criterios de exclusión incluían los niveles de enzimas hepáticas fuera del rango normal, el VIH crónica o infección por el VHC, o pruebas de cualquier otra clínicamente significativa aguda o crónica enfermedad. Sujetos que recibían la medicación de supresión inmune, y los diagnosticados con un auto-inmune o disfunción no se consideraron para este estudio. Femenino temas tuvo que han pasado por la menopausia por al menos un año, como lo demuestra la falta de menstruación durante los últimos 12 meses y las hormonas (FSH, estradiol) la sangre de medición de nivel de selección a confirmar la menopausia.

Vacunas

Para la producción de un lote de clínica IMP321, CHO DHFR - células fueron transfectadas con un plásmido que codifica la D1-D4 extra-celular de dominios humanos GAL-3 fundido a la cola Fc de una IgG1 humana [11]. Una producción clon fue seleccionado después de amplificación en methothrexate. El último lote de contenedores clínicos utilizados en el presente estudio tiene una concentración de 1,1 mg / ml IMP321 (a 200 kDa dimeric proteína) y 0,09 UE / mg de endotoxina, 0,4 ng / ml de ADN y 6 ng / ml célula huésped contenido de proteínas. Experimental vacunas que figuran 10 μ g de levadura recombinante derivado del HBsAg (siempre de Rhein Biotech GmbH, Düsseldorf) solo o con 3, 10, 30, 100 μ g IMP321 (hLAG-3Ig). Todas las vacunas han sido preparadas por un farmacéutico no cegados en el centro de ensayo y se les administró el plazo de 1 h de la mezcla utilizando un 200 μ l volumen de inyección. Cada sujeto recibió tres sub-cutánea (sc) dosis a los 0, 4 y 8 semanas. La primera y la tercera inyecciones se realizaron en la zona deltoidea del brazo dominante. La segunda inyección se hizo en la zona deltoidea del brazo no dominante. Temas comparativos en otro brazo de un adulto recibieron dosis (1 ml) de Engerix-B ® (GlaxoSmithKline, Rixensart, Bélgica) que contiene 20 μ g de alumbre-absorbida por levaduras de origen recombinante HBsAg, que se administró por vía intramuscular.

Grupos experimentales

Los sujetos fueron matriculados secuencialmente en cuatro cohortes de acuerdo a nivel de dosis de IMP321. Dentro de cohortes, los sujetos fueron asignados al azar a recibir una vacuna experimental de control de HBsAg o solo en un ratio 4:1. Un total de 48 sujetos fueron inmunizados de acuerdo con los planes de tres administraciones, el 8 de la recepción de control de vacunas, 8 de la recepción de Engerix-B ® y 32 que reciben vacunas experimentales con IMP321 (n = 8 en cada grupo). Dos sujetos fueron suspendió prematuramente del estudio después de la primera inyección y fueron sustituidos.

La evaluación de la seguridad

Todos los sujetos que recibieron una dosis del fármaco del estudio se incluyeron en la evaluación de la seguridad (n = 50). Los efectos adversos fueron identificados por examen clínico en la línea de base y en las siguientes horas post administración: primera dosis a las 4 h, 48 h, una semana, y 4 semanas (justo antes de la segunda dosis); segunda dosis a 4h, 48 h, una semana y 4 semanas (justo antes de tercera dosis de vacuna); tercera dosis a las 4 h, 48 h, una semana y 4 semanas. Además, los signos vitales (presión arterial y la frecuencia del pulso) y la temperatura corporal oral se registraron en pre-dosis, 0,5 h, 1 h, 1,5 h, 2 h, 4 h después de la dosificación, así como 48 horas y 1 semana después de cada la inyección. Las pruebas de laboratorio incluyen un recuento sanguíneo completo, química suero, el hígado y la función renal y la coagulación. Factores reumatoide, anti-nuclear títulos de anticuerpos (ANA) y anti-IMP321 anticuerpos fueron medidos al inicio del estudio y las semanas 12.

La inmunogenicidad de respuesta humoral

Inmunogenicidad resultados se analizaron utilizando la población que completaron el estudio (n = 48). Para evaluar anti-HBsAg respuestas, muestras de sangre obtenidas en la línea de base y 8 y 12 semanas después de la vacuna de dosis inicial, se permitió que los coágulo a temperatura ambiente durante 15 minutos. Las muestras fueron centrifugadas a 1500 g en aproximadamente 4 ° C durante 10 minutos y el suero se aliquoted y almacenados en recipientes herméticamente cerrados tubos de tapón de polipropileno a -20 ° C. Los sueros fueron probados por el Abbott AUSAB-Meia (Abbott, Abbott Park, IL, EE.UU.) y anti-HBs títulos se expresaron en mUI / mL basado en la comparación con los estándares definidos por la Organización Mundial de la Salud (OMS). A título de protección se definió como ≥ 10 mUI / ml. El comercialmente disponible vacuna contra la hepatitis B Engerix-B ® (20 μ g HBsAg adsorbido en aluminio) se utilizó para asegurar que nuestros 3 meses de calendario protocolo fue capaz de inducir anticuerpos en la mayoría de los sujetos. Media geométrica de los títulos (GMT) se calculó utilizando la fórmula 10 significa [log (Ab títulos)] para cada grupo en cada momento. Seronegativos sujetos se les ha dado el valor arbitrario de 1 mUI / mL para el cálculo GMT.

El análisis de los datos

Los análisis de la seguridad y la tolerabilidad parámetros se realizaron en todos los temas aleatorios que recibieron al menos una dosis de la medicación de estudio y que había después de la dosis de seguridad de información (n = 50). Inmunogenicidad resultados se analizaron en la población que completaron el estudio (es decir, los sujetos que recibieron 3 inyecciones y había después de su visita de estudio) (n = 48). Anti-HBsAg títulos medido en mUI / ml se expresaron como media geométrica de los títulos (GMT) para cada grupo. Las diferencias entre GMTs alcanzado en un momento determinado punto para cada uno de los más IMP321 HBsAg o los grupos de Engerix-B ® grupo se compararon con el HBsAg solo grupo de estudiantes de dos caras t-test. Las proporciones de sujetos lograr la seroconversión (anti-HBsAg ≥ 1 mUI / ml) y de seroprotección (anti-HBsAg ≥ 10 mUI / ml) fueron comparados en los grupos combinados IMP321 y en la Engerix-B ® versus el grupo control solo grupo de HBsAg.

La inmunogenicidad de las respuestas celulares
Ex vivo la estimulación de PBMC y dentro de tinción celular

Antes de evaluar HBsAg específicos de las células T seguir las respuestas a la eficacia del protocolo de vacunación, la validación experimentos se realizaron en cuatro PBMCs las muestras obtenidas de voluntarios que habían sido previamente inmunizados con comercial vacuna contra la hepatitis B. PBMCs fueron descongelados y estimulado el uso de un conjunto de 22 20-dores péptidos (la superposición de 11 bis) que abarcan toda la secuencia de la proteína HBsAg (1 μ M de cada péptido) o cultivadas, con el vehículo (DMSO), en presencia de FastImmune CD28 / CD49d costimulation cóctel (BD Biosciences) durante 18 h, y en presencia de brefeldin A (BD Biosciences) para los últimos 16 h. En otra serie de experimentos, PBMC muestras de otros tres donantes fueron estimulados con un citomegalovirus (CMV) pp65 péptidos piscina (1,75 μ g / ml, BD Biosciences) o Staphylococcus enterotoxina B (SEB, 1 μ g / ml, Sigma Aldrich) en el mismo condiciones. PBMCs unstimulated o estimulada con péptidos o SEB se fija, permeabilised utilizando CytoFix / CytoPerm, manchado con conjugado con fluorocromo-CD3-Cy5.5-PerCP, CD4-PE-Cy7, CD8-APC-Cy7, IFN-γ-FITC, TNF - APC-α y la IL-2-PE anticuerpos y ampliamente PermWash lavados con buffer (todos de BD Biosciences). Las células fueron analizados utilizando un 6 colores FACSCanto citómetro de flujo (BD Biosciences) para determinar el porcentaje de CD4 + CD3 + y CD8 + CD3 + células que expresan IFN-γ, TNF-α y / o IL-2. El porcentaje de células que expresan citocinas en unstimulated condiciones se resta del porcentaje de células obtenidas después de la estimulación péptido. Tras la conclusión del protocolo, una serie de muestras de la agrupación toda la cinética de cada uno de los incluidos en el ensayo clínico fueron descongelados y analizado después de 18 h de ex-vivo restimulation utilizando el mismo conjunto de péptidos HBsAg. Las células fueron fijadas, teñidas permeabilised y como se indica más arriba. Un gran número de PBMCs se analizaron (un promedio de 0,9 × 10 6 células) por citometría de flujo para garantizar la validez de los pequeños porcentajes y / o diferencias. Resultados FACS siguiente análisis se define como la diferencia en respuesta a HBsAg-péptidos en D29, D36, D57 o D85 versus D1. El intervalo de confianza depende de que el número de eventos (CD3 + CD4 + o CD8 + CD3 + eventos) recogidos en cada una de las muestras, la cantidad de antecedentes a la estimulación D1 y la diferencia entre D1 y D29, D36, D57 o D85 puntos temporales. Esta diferencia fue significativa con una potencia de 90% (p <0,05) si el número de CD4 + o células CD8 + se recogieron más grande que calcula CD4 + o CD8 + eventos utilizando la fórmula siguiente:

2 × ( ( D ÷ 100 + D 1 ÷ 100 ) ÷ 2 ) × ( 1 -- ( ( D ÷ 100 + D 1 ÷ 100 ) ÷ 2 ) × 8,6 ) ( D ÷ 100 -- D 1 ÷ 100 ) 2 MathType MTEF @ @ @ 5 + 5 = @ feaafiart1ev1aaatCvAUfKttLearuWrP9MDH5MBPbIqV92AaeXatLxBI9gBaebbnrfifHhDYfgasaacH8akY = wiFfYdH8Gipec8Eeeu0xXdbba9frFj0 = OqFfea0dXdd9vqai = hGuQ8kuc9pgc9s8qqaq = dirpe0xb9q8qiLsFr0 = = vr0 vr 7456 @ @

donde D es el porcentaje de CD3 + CD4 + o CD8 + CD3 + células que expresan al menos uno de citoquinas en D29, D36, D57 o D85 a la estimulación y D1, el porcentaje de CD3 + CD4 + o CD8 + CD3 + células que expresan al menos una citoquina en D1.

Encuadernación de HBsAg específicos pentamers

Una vez completado el protocolo, PBMC cosechada de un HLA-A2 + donantes en D1, D57 y D85 fueron descongelados y cultivadas con dos HLA-A2-restricted HBsAg péptidos (GLSPTVWLSV y WLSLLVPFV, 1 μ M cada uno) en presencia de IL-2 (20 UI / ml) durante 10 días. Fresh autologuous PBMC se cargaron con los dos péptidos y añadió a la cultura de más de 10 días. Fresh IL-2 se añade cada dos días durante las dos rondas de estimulación. Las células fueron incubadas con los dos HBsAg peptides/HLA-A2 pentamers (HLA-A * 0201) conjugado con PE, lavado, teñido con CD3-Cy5.5-PerCP, CD4-APC-Cy7, CD8-FITC, CD14-APC anticuerpos y analizadas por citometría de flujo. Tras la exclusión de monocitos CD14 +, la unión de pentamers en CD3 + células CD8 + se determinó.

Resultados
Características de la Población

Este estudio se realizó entre mayo de 2005 y diciembre de 2005. Un total de 113 sujetos fueron controlados, de los cuales 50 se matricularon y recibieron al menos una dosis de vacuna. Base de datos demográficos y características fueron distribuidas de manera uniforme entre los seis cohortes, con la excepción de la edad en el HBsAg incrementado en un 10 μ g IMP321 grupo (Cuadro 1]. Todos menos dos sujetos completaron el estudio. Un tema en el HBsAg + 3 μ g IMP321 y uno de los temas tratados en el HBsAg + 10 μ g IMP321 se retiró del estudio después de la primera inmunización por razones personales. Ellos fueron sustituidos por otros 2 temas.

La seguridad y la tolerancia

En general, IMP321 más HBsAg se caracterizó por un buen perfil de tolerabilidad en los cuatro dosis probadas. Una menor incidencia de los sujetos que experimentan entidades se informó después de la inyección de más IMP321 HBsAg (38%) o solos HBsAg (25%) que después de la inyección de Engerix-B ® (62,5%). Los más comunes observados no graves acontecimientos adversos locales incluyen dolor en el sitio de inyección (4 / 35) y eritema (2 / 35), así como síntomas sistémicos tales como náuseas (2 / 35) y cefalea (5 / 35) (véase el cuadro 2]. El lugar de la inyección dolor y eritema fueron considerados sin duda relacionadas con el estudio de las drogas, mientras que las náuseas y el dolor de cabeza se consideraron posiblemente relacionados. La mayoría de estas entidades fueron de intensidad leve a moderada intensidad y se resolvieron sin ningún tipo de tratamiento correctivo. A raíz de la vacuna inyectable, oral temperatura, la presión arterial, frecuencia del pulso y se mantuvo estable desde el inicio hasta 4 horas, así como en el día 3 y 8 días después de la dosificación (datos no presentados). Un tema de la HBsAg, más de 100 μ g IMP321 grupo desarrolló un prurito y una erupción papular 2 horas después de la primera inyección, lo que podría ser indicativo de una reacción alérgica, los síntomas son transitorios, no se reproduce después de las siguientes inyecciones y no médico o intervención farmacológica era necesario.

No hubo coherente o relacionada con la dosis a los cambios hematológicos o bioquímicos reumatológicas medidas (datos no presentados). Por otra parte, los anticuerpos frente a IMP321 no se hayan detectado en el suero de temas recogidos en D29, D36, D57 y D85 (no se muestra). En conjunto, estos datos ponen de manifiesto que las inyecciones de IMP321 fueron bien toleradas con pocas informó de entidades no graves y no se detectan indicios de autoinmunidad inducida.

Vacuna contra la inmunogenicidad
Validación de los intercambios intracomunitarios de tinción celular ex vivo después de la estimulación con péptidos

Antes de evaluar HBsAg específicos de las células T de respuesta intracelular tinción para detectar las citocinas en las células T por citometría de flujo después de análisis a corto plazo ex-vivo de estimulación con una piscina de 22 HBsAg superposición de péptidos (20 aa la superposición de 11), los procedimientos estándar de operación y se establecieron fijo. En primer lugar, muestras de sangre a partir del 4 de distintos donantes previamente inmunizados por una vacuna contra la hepatitis B fueron recogidos independientemente y PBMCs purificado y congelados por dos operadores distintos. PBMCs fueron entonces estimulados por el péptido HBsAg piscina durante 18 horas en presencia de brefeldin A y teñidas con-conjugado con fluorocromo CD3, CD4, CD8, IL-2, INF-γ y TNF-α-anticuerpos específicos. Los porcentajes de CD4 + CD3 + y CD8 + CD3 + células que expresan citoquinas después de HBsAg-estimulación obtenidos por los dos operadores se presentan en la Figura 1. Sólo dos donantes de cada cuatro había desarrollado un nivel detectable del antígeno-específicos de citoquinas Th1 respuesta de CD4 después de HBsAg péptido piscina estimulación (Figura 1A]. No CD8 + T cell respuesta de citoquinas se observó (Figura 1B]. Se obtuvieron resultados similares en los experimentos realizados por los dos operadores diferentes.

Desde CMV-CD8 específicas respuestas son fáciles de observar en condiciones normales de los donantes, la reproducibilidad de la intra-celular método de tinción para detectar la expresión de citoquinas en CD4 y CD8 subpoblaciones de células T se realizó tras la estimulación con un péptido piscina que abarca la secuencia de CMV pp65. PBMCs de tres donantes fueron estimulados con el CMV pp65 péptidos y teñidas para detectar la expresión de citoquinas en diez experimentos independientes realizadas por dos operadores (Figura 2A y 2B]. Control de la estimulación con SEB superantigen fue agregado (Figura 2C y 2D]. Las tres muestras de PBMC muestran un nivel detectable de citoquinas en respuesta tanto CD4 y CD8 subconjuntos de células T después de CMV pp65 estimulación. Una alta frecuencia de CMV pp65-TC1 específicas linfocitos T CD8 + se encontró en los donantes # 2 del PBMCs (> 1%, la Figura 2B, panel central). Los medios y las desviaciones estándar de los porcentajes de CD4 + y CD8 + T células que expresan estas citoquinas fueron calculadas para los tres donantes. Interamericano de experimentos y entre los operadores coeficiente de variación (CV) fueron determinados. Repetibilidad de los resultados obtenidos por cada operador fue de 17% y 14% para ambas poblaciones de células T. En general entre los experimentos y entre los operadores de CV fueron 19% y 15% para el antígeno específico de CD4 y CD8 respuesta, respectivamente. Interamericano de experimentos y entre los operadores de CV calculado para SEB-estimulación fueron 19% y el 10% de CD4 y CD8 la población, respectivamente. Para evitar la variabilidad adicional, el control de la respuesta de células T en el ensayo clínico fue realizado por un solo operador que obtiene el 15% y 14% en CV CD4 y CD8 de antígenos específicos de las respuestas, respectivamente.

Hepatitis B-específica de células T respuestas

Para investigar la respuesta de células T para HBsAg vacunación en los diferentes grupos, PBMCs se cultivaron durante 18 h con la misma piscina, de 22 de HBsAg superposición de péptidos y el número de antígenos específicos de células T se determinó por citometría de flujo después de IFN-γ, TNF - α y la IL-2 intracelular manchas en CD3 + CD4 + y CD8 + CD3 + células. El porcentaje de CD4 + T que expresan estas células de tipo Th1 citoquinas tras la estimulación con péptidos antigénicos se muestra en la Figura 3.

Cinco temas de los 8 (62,5%) en el Engerix-B ® grupo muestra un aumento en el porcentaje de células T CD4 que expresan citoquinas tras la estimulación con HBsAg péptidos en D29, D36, D57 o D85 en comparación con D1 (Figura 3A]. En cambio, no sujeto muestra un aumento significativo del porcentaje de respuesta T CD4 + en las células HBsAg solo grupo (Figura 3B], lo que indica que el antígeno por sí solo no ha podido inducir a un nivel detectable T CD4 + células respuesta, incluso en un antígeno - experimentado tema (# 044) que se convirtió en seroprotegidos después de la vacunación (Tabla 3]. En los grupos que reciben IMP321, un aumento en la frecuencia de CD4 + específicas de las células T productoras de tipo Th1 citoquinas se observó en 2 asignaturas (25%) en los 3 y 10 μ g grupos (Figura 3C y 3D], 3 sujetos en el 30 μ g grupo (37,5%, Figura 3E] y 4 en los 100 μ g grupo (50%, Figura 3F]. De este modo la exposición a IMP321 está asociado con la inducción de un nivel detectable del antígeno-específica de células Th1 CD4 respuesta en 25 a 50% de los sujetos en comparación con el 0% en ausencia de IMP321. Es de señalar que ninguno de los tres antígenos de los sujetos con experiencia previa a la vacunación CD4 desarrollado una respuesta Th1 aunque Ab títulos fueron impulsadas (véase más arriba). Es importante destacar que la cinética de distribuir T CD4 + células respuesta fue heterogénea en responder temas. Si bien la respuesta de células T siguió aumentando con el tiempo de tres temas (dos en la Engerix-B ® grupo, uno en la IMP321 100 μ g grupo), se debió repetir las inyecciones en todos los demás en una disminución de Th1 CD4 de células T frecuencias en la sangre.

Además del aumento del número de materias que muestra una Th1 respuesta de células CD4 en los grupos IMP321 en comparación con HBsAg sola, la magnitud de la respuesta Th1 fue también determinado. La figura 4 muestra multiplicado por el porcentaje de CD4 + T células que expresan al menos uno de citoquinas a HBsAg estimulación en D29, D36, D57 y D85 versus D1 para cada respuesta. En los temas que muestran un aumento significativo, CD4 + T cell respuesta parece ser más intenso en las cohortes de 10 o 30 μ g IMP321 en comparación con el 3 μ g y 100 μ g. Sorprendentemente, a D29, es decir, después de una sola inyección, la respuesta en IMP321 beneficiarios fue tan intensa como la observada en el Engerix-B ®. Como se mencionó anteriormente, la intensidad de la respuesta a D85 parece disminución en comparación con otros puntos temporales en todos los grupos, mientras que 2 sujetos en la Engerix-B ® grupo muestra un continuo aumento en la intensidad de la respuesta.

Para los primeros puntos temporales D29, IMP321 incrementado en un 10 μ g de HBsAg es lo más eficiente en inducir al CD4 + T cell respuestas como una vacuna comercial de la incorporación de 20 μ g HBsAg adsorbido en aluminio, un proceso conocido para proteger de la degradación de HBsAg con, además, un depósito de efecto de larga duración para la liberación de antígenos. Para más adelante los puntos, la mezcla de IMP321 más HBsAg no es capaz de inducir nuevos aumentos (en contraste con Engerix-B ® en dos personas).

En cuanto a la producción de citoquinas TC1 de linfocitos T CD8 + ex vivo después de la estimulación con HBsAg péptidos, sólo unos pocos temas desarrollados una mayor frecuencia de linfocitos T CD8 +, al menos, a una cinética de tiempo en comparación con el punto de referencia. En contraste con la fuerte respuesta de los CD4 + T las células de la mayoría de los temas en los Engerix-B ® grupo, un leve pero significativo CD8 + T cell respuesta se observó en sólo dos asignaturas (25%) un mes después de la primera inyección de la vacuna (Figura 5A]. En HBsAg y solo 3 o 10 μ g IMP321 grupos, un voluntario de 8 (12,5%) muestran un aumento significativo del porcentaje de células T CD8 expresan IFN-γ, TNF-α o IL-2 (Figura 5B, C, y 5D]. En el 30 o 100 μ g IMP321 grupos, respectivamente, 2 (25%) y 3 (37,5%) mostraron un aumento en el porcentaje de respuesta linfocitos T CD8 + (Figura 5E y 5F]. En cuanto a la magnitud de los TC1 respuesta a temas que muestran un aumento significativo de linfocitos T CD8 +, uno de los temas tratados tanto en el 30 μ g y los 100 μ g grupos muestran una intensa respuesta (Figura 6].

En cuanto a los CD4 + células T respuesta, la respuesta de las células CD8 evaluado en nuestro corto plazo ex vivo de ensayo se redujo después de repetidas de vacunación. PBMCs de uno de los temas tratados en los 100 μ g IMP321 grupo (# 037, HLA-A2 +) que muestra un nivel detectable Th1 y un TC1 respuesta sólo después de una inmunización (D29) y no responde después de la segunda y la tercera inmunización, se cultivaron por un o dos rondas de la estimulación in vitro con dos HLA-A2-restricted péptidos. Después de la amplificación de células T específicas con los péptidos, el número de linfocitos T CD8 + que lleven una TCR de reconocer uno de estos dos péptidos presentados por HLA-A2 moléculas se determinó mediante la tinción con pentamers cargado con los péptidos (Figura 7]. El porcentaje específico de linfocitos T CD8 + detectado con pentamers fue mayor en PBMC de D57 y D85 en comparación con D1. Por otra parte, 10 días de estimulación era suficiente para inducir el 2,4% de HBsAg específicas linfocitos T CD8 + de PBMC recogidos después de la tercera inmunización. Así pues, incluso si no detectables de citoquinas de células T positivos se detectaron en el corto plazo, nuestro ex vivo de ensayo, específicas de linfocitos T CD8 + con vigoroso potencial proliferativo siguen presentes en números bajos (es decir, por debajo de la detección de CSI ensayo umbral del 0,01% para las células CD8) después de repetidas inyecciones de IMP321.

Discusión

Para estudiar la eficacia de IMP321 como immunopotentiator en el hombre, hemos utilizado el estado de la técnica immunomonitoring técnicas (es decir, directa ex vivo color 6 FACS análisis de antígeno específico de CD4 o CD8 células productoras de IL-2, IFN γ o TNF - α detectado como de intercambios intracomunitarios de tinción celular). Intra-métodos de tinción celular permiten la fenotipificación de las citocinas que producen las células con una buena reproducibilidad (Figuras 1 y 2] sin ningún tipo de clasificación de células según sea necesario con el método estándar ELISPOT. Por otra parte, en una única célula, varias citocinas pueden ser detectados, lo cual no es posible, valiéndose del ELISPOT, lo que permite una mejor cobertura de los subgrupos heterogéneos siendo inducida (por ejemplo, IL-2 para la memoria fenotipo).

En el presente estudio, tanto los altos niveles de Th1 CD4 y TC1 células T CD8 (es decir, más de 0,1% en el subgrupo correspondiente) se han detectado en algunos individuos inmunizados con 10 o 30 μ g IMP321 y 10 μ g de HBsAg sin alumbre a pesar de que el HBsAg es, probablemente, a una dosis subóptima debido a la ausencia de protección contra la degradación de antígenos o de un depósito efectos a partir de la alumbre. El mismo resultado también ha sido obtenido en una anterior fase I de ensayo de prueba el 10 y el 30 μ g IMP321 y una vacuna contra la gripe (manuscrito presentado).

En comparación con alumbre, la inyección de IMP321 con 10 μ g de HBsAg fue equivalente en términos de CD4 + T cell respuestas a la inyección de 20 μ g de alumbre-absorbida HBsAg (es decir, Engerix-B ®) después de la primera inyección, a pesar de que no era ni la protección ni de antígenos cualquier efecto de depósito de antígenos en la antigua condición. Sin embargo, no hubo coherente acumulación de cualquiera de CD4 o CD8 respuestas después de la segunda y tercera inyección. De hecho, se observó una disminución de la respuesta que circulan células T después de D29 en la mayoría de los temas. Sigue siendo posible que las células T antígeno que se convirtió en experiencia después de la primera casa de inmunización en los órganos linfoides siguientes vacunas posteriores. De hecho, son muy pocos los antígenos específicos de células CD8 (es decir, indetectables, sin amplificación in vitro) se mantuvo en la sangre a D57 o D85, de acuerdo con observaciones anteriores muestran una compartimentación de los tejidos linfoides [12].

A pesar de más de 10 años de investigación, los agonistas TLR no han logrado demostrar la buena respuesta de células T adjuvanticity ratio in vivo. Por ejemplo, CpG ODN han demostrado aumentar los títulos de Ig HBsAg y Ab afinidad, pero la inducción de HBsAg específicos de las células T no pudo ser detectada en directo ensayos ex vivo (es decir, sin ningún tipo de sesgo inducido in vitro por la proliferación de linfocitos) en vacunados sanos las personas co-inyectados con dosis de 3 mg ISS [13] o con 1 mg CpG ODN [14], respectivamente. Del mismo modo, las cohortes de 30 individuos sanos vacunados con una dosis completa de vacuna contra la gripe (Fluarix ®), más de 1 mg CpG 7909 no puso de manifiesto una mayor respuesta celular inducida por CpG [15]. Por lo tanto, el potencial de TLR9 ligandos para mejorar las respuestas CTL en el ser humano tiene hasta la fecha no se ha demostrado, con la excepción de un estudio clínico la investigación de una vacunación de los pacientes con melanoma con un péptido Melan/MART-1 más de 0,5 mg CpG emulsionar en Montanide ® [16].

Conclusión

En conclusión, IMP321 como coadyuvante de los HBsAg fue bien tolerada y una mayor respuesta de células T inmunogenicidad de vacunas (es decir, inducida tanto CD4 Th1 y CD8 TC1 antígeno específico de células T). Su capacidad para orientar la respuesta inmune a Th1/Tc1 fue confirmada por el mayor aumento en el celular que la respuesta humoral como cabría esperar de una vacuna terapéutica adyuvante. Los futuros estudios clínicos están en curso para evaluar el potencial de este tipo no inflamatorio no TLR ligandos utilizado solo o como adyuvantes de vacunas terapéuticas.

Conflicto de intereses

Los autores son empleados de Immutep SA y F. Triebel tiene intereses de equidad en Immutep SA

Autores de las contribuciones

CB supervisó la farmacodinamia parte del estudio, estuvo involucrado en el análisis de datos y en la redacción del manuscrito. CG realizado inmunoensayos, adquisición de datos y análisis. MM llevó a cabo el aislamiento de células sanguíneas y la estimulación. GP participó en la coordinación del estudio y en la redacción del manuscrito. FT concebido y supervisado el estudio y finalizó el manuscrito. Todos los autores leído y aprobado el manuscrito final.

Agradecimientos

Nos gustaría dar las gracias a Rhein Biotech, por haber proporcionado el HBsAg sin alumbre y por su ejemplar apoyo durante el estudio.