Mediators of Inflammation, 2007; 2007: (más artículos en esta revista)

Calotropis procera Latex Extracto protege contra la inflamación y estrés oxidativo en Freund's Complete adyuvante-Monoarthritis inducida en ratas

Hindawi Publishing Corporation
Vijay Kumar L. [*], Sanjeev Roy

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Resumen

En vista de la bien establecida propiedades anti-inflamatorias de látex de Calotropis procera (DL), el presente estudio se llevó a cabo para evaluar el efecto protector de su extracto de metanol (MeDL) contra la inflamación y estrés oxidativo en monoarthritis Freund inducida por adyuvante completo de (FCA) en ratas. Intra-articulares de inyección de FCA producido la inflamación de la articulación con un máximo efecto se produce el día 4 cuando un incremento máximo en los niveles de myeloperoxidase y mediadores de la inflamación como PGE 2, TNF-α, y el óxido nítrico se observó. Esto se asoció con estrés oxidativo, con una marcada reducción en los niveles de glutation, catalasa, superóxido dismutasa y la glutatión peroxidasa y un aumento en la peroxidación lipídica como se indica en los niveles más altos de ácido tiobarbitúrico sustancias reactivas (TBARSs). Posteriormente el día 28 el análisis histológico de los conjuntos también reveló cambios artríticos. El tratamiento diario de las ratas con MeDL (50 y 500 mg / kg) y el nivel antiinflamatorio rofecoxib (20 y 100 mg / kg), produjo una atenuación significativa en la respuesta inflamatoria y mejorado los cambios artríticos en la articulación. La protección otorgada por MeDL y rofecoxib fue más pronunciada que la de fenilbutazona y haya estado relacionada con la normalización de los niveles de mediadores inflamatorios y los parámetros bioquímicos de estrés oxidativo. Sin embargo, la protección general que ofrece el rofecoxib fue mejor que la de MeDL.

1. INTRODUCCIÓN

La incidencia de afecciones degenerativas y enfermedades articulares inflamatorias, es decir, la osteoartritis y la artritis reumatoide, es muy alto en el mundo entero [1, 2]. Normalmente la artritis es un trastorno inflamatorio de la articulación se caracteriza por la inflamación de la membrana sinovial, el dolor, y de restricción de circulación conjunta. Experimentalmente, la artritis puede ser inducida por diversos inflammagens de que Freund completo del adyuvante (FCA) es el más comúnmente usado agente [3, 4]. Intra-articulares de inyección de FCA se sabe que inducen la inflamación, así como la respuesta inmune y para producir características que se asemejan a la artritis reumatoide en los seres humanos. La respuesta inflamatoria aguda inducida por la FCA está asociada con la infiltración de leucocitos, la activación de las células mástil, y la liberación de citoquinas y radicales libres [5, 6]. Este proceso se agrava con la activación de macrófagos y la secreción de productos bioactivos que desempeñar un papel importante en la destrucción de los tejidos, proliferación vascular y fibrosis en un período de tiempo [7].

El papel de las citocinas como la IL-1, IL-6, factor de necrosis tumoral-α (TNF-α), prostaglandinas (págs), y óxido nítrico (NO) en la artritis ha sido bien establecida. Los niveles de estos mediadores de la inflamación se ha informado de que se de alta en ambos modelos experimentales de artritis y en los pacientes que sufren de artritis [8, 9]. Además, la generación de especies reactivas del oxígeno (ROS) y otros radicales libres también contribuyen a la patogénesis de la artritis [10]. En vista de los mecanismos subyacentes, tanto nonsteroidal esteroides y antiinflamatorios se utilizan para la gestión de la artritis [11]. Sin embargo, debido a efectos secundarios asociados con el uso a largo plazo de estos agentes, muchos pacientes tienden a utilizar otros enfoques terapéuticos incluyendo terapias a base de plantas que han sido considerados seguros y efectivos para aliviar el dolor crónico asociado con la artritis [12].

Calotropis procera (Ait.) R. Br., Un crecimiento de plantas silvestres de la familia Asclepiadaceae, es bien conocida por sus propiedades medicinales. Diferentes partes de esta planta se ha informado a exposición anti-inflamatorio, analgésico, antioxidante y propiedades [13]. El látex de esta planta produce potente anti-inflamatorio, analgésico, antipirético y la debilidad de efectos en varios modelos animales [14 - 16]. Ambos látex y su extracto de metanol (MeDL) han demostrado inhibir la afluencia de células inflamatorias y la formación de edema inducido por diversos inflammagens [17]. También mejora las funciones del aparato locomotor en monoarthritis inducida experimentalmente en ratas (resultados no publicados). En vista de estas propiedades, el presente estudio se llevó a cabo para evaluar el efecto de MeDL en los niveles de PGE 2, TNF-α, el óxido nítrico (NO), myeloperoxidase (MPO), los parámetros de estrés oxidativo, y la histología en conjunto FCA - monoarthritis inducida en ratas. El efecto de MeDL se comparó con rofecoxib, un selectivos de la COX-2 (ciclooxigenasa-2) inhibidor, y fenilbutazona (PBZ) un inhibidor de la COX nonselective.

2. MATERIAL Y MÉTODOS
2,1. Material vegetal y las drogas

El C. procera planta fue identificado por las materias primas, el Herbario y Museo División, Instituto Nacional de la Ciencia y la Comunicación, CSIR, Nueva Delhi, donde un bono espécimen se conserva (no Bono. PID 1739). El látex se recogieron de la parte aérea de la planta que crece en estado silvestre. Se seca bajo la sombra a temperatura ambiente y se soxhlated para obtener extracto de metanol (MeDL) [18]. El MeDL se triturated con la goma de acacia utilizarse como agente de la suspensión (1: 1) en solución salina normal (NS), y administrarse por vía oral a ratas a dosis que van desde 50 a 500 mg / kg (MeDL 50 y MeDL 500). El rofecoxib se administra por vía oral a 20 y 100 mg / kg dosis (20 y ROfE ROfE 100) y la fenilbutazona a una dosis de 100 mg / kg (PBZ). Los fármacos utilizados en el estudio se obtuvieron a partir de Arbro Farmacéutica (Nueva Delhi, India) (rofecoxib y fenilbutazona). Freund completa de los adyuvantes se obtuvo de Sigma-Aldrich Corporation (Bangalore, India).

2,2. Animales

El estudio se llevó a cabo el 5-6 meses de edad ratas Wistar de uno u otro sexo, un peso 150-180 g. Las ratas fueron obtenidas a partir de la Facilidad Experimetal Animal del Instituto, se mantuvieron a temperatura ambiente, y tienen libre acceso al agua y la dieta. Los experimentos con animales se realizaron de conformidad con las directrices institucionales del Comité de Ética Animal.

2,3. Diseño experimental

Monoarticular la artritis fue inducida en ratas mediante la inyección de 0,1 ml de 0,1% FCA (Sigma Aldrich, EE.UU.) en el intra-articular el espacio de articulación del tobillo derecho (día 0) [19]. El aumento en conjunto se midió el diámetro diario a partir del día 0, utilizando un tornillo calibrar hasta el momento de mayor volumen de la inflamación (día 4) y, a continuación, se midió cada cuatro días durante un período de 28 días. Las ratas fueron divididas en siete grupos, que consta de seis animales cada uno para su análisis histológico y de los parámetros bioquímicos. Grupo I: control normal; Grupo II: FCA control. En el Grupo III al Grupo VII, la droga se administra por vía oral como la suspensión con la goma de acacia en el NS, 1 hora antes de la inyección de FCA en el día 0 y luego a diario, ya sea por 4 días o durante 28 días a dosis basada en nuestros estudios anteriores que no pueden observarse efectos tóxicos se observó a [17, 20, 21], Grupo III: MeDL (50 mg / kg, MeDL 50); Grupo IV: MeDL (500 mg / kg, MeDL 500); Grupo V: rofecoxib (20 mg / kg, 20 ROfE ); Grupo VI: rofecoxib (100 mg / kg, ROfE 100); Grupo VII: fenilbutazona (100 mg / kg, PBZ).

2,4. Determinación de los niveles de estrés oxidativo y los parámetros de mediadores inflamatorios

Los niveles de los marcadores bioquímicos de estrés oxidativo y los mediadores de la inflamación se determina en el sitio de la inflamación. Los animales fueron sacrificados en el momento de mayor volumen de la inflamación (día 4) y el tejido de los artríticos conjunta fue removido y procesado para la estimación de glutation (GSH, en mg / g de tejido) [22], catalasa (U / mg de proteína) [23 ], Superóxido dismutasa (SOD, U / mg de proteína) [24], glutatión peroxidasa (GPx, U / mg de proteína) [25], ácido tiobarbitúrico sustancias de reacción (TBARSs) como medida de malondialdehído (MDA, nmol / g de tejido ) [26], el óxido nítrico (NO, μ M / mg tejido) [27], la prostaglandina E 2 (PGE 2, pg / mg tejido, R & D Systems), factor de necrosis tumoral-α (TNF-α, pg / mg tejido , Diaclone Investigación), y myeloperoxidase (MPO, OD / mg tejido) [28].

2,5. Estimación de proteína

La concentración de proteínas de las muestras se determinó por el método de Bradford [29].

2,6. El análisis histológico

Las ratas se sacrificaron el día 28, los miembros fueron retirados por encima de la sofocar las articulaciones, degloved y fija en el 1% de formaldehído en solución salina. Ellos fueron descalcificadas en EDTA, transformados para la integración de parafina, seccionadas y teñidas con hematoxilina-eosina [30]. Las secciones fueron examinadas por los cambios artríticos en el control, así como en el de drogas ratas tratadas.

2,7. El análisis estadístico

Los valores se expresan como media ± SEM de seis observaciones y ANOVA se utilizó para comparar los grupos. El análisis estadístico se llevó a cabo por la versión 10 del programa SPSS y los valores de P <.05 Se consideró como estadísticamente significativo.

3. RESULTADOS
3,1. Efecto de MeDL en común la inflamación

La inyección de FCA en tobillo derecho de rata se tradujo en un incremento en conjunto de diámetro que fue máximo en el día 4 (2,17 ± 0,13 mm), y luego disminuyó gradualmente. La inyección de NS, por otra parte produce un aumento marginal en el conjunto de diámetro en el día 2 (0,04 ± 0,10 mm) que volvió a la normalidad dentro de 4 días (Figura 1].

El efecto inhibidor de diversas drogas fue evaluado el día de mayor volumen de la inflamación, es decir, el día 4. La administración oral de MeDL producido una dosis-dependiente disminución de la inflamación conjunta y el aumento de diámetro conjunta fue 1,59 ± 0,09 mm y 1,20 ± 0,08 mm en MeDL 50 y MeDL 500 grupos en contra de 2,17 ± 0,13 mm en la FCA de control (27% y 45% inhibición). COX-2 inhibidor selectivo, rofecoxib, fue más eficaz en la inhibición de la inflamación conjunta en comparación con MeDL. El aumento de diámetro en conjunto ROfE 20 y ROfE 100 grupos fue 1,66 ± 0,08 mm y 0,70 ± 0,33 mm (24% y 68% de inhibición). PBZ, un inhibidor de la COX nonselective producido el 16% de inhibición de la inflamación en conjunto con el aumento en conjunto diámetro de 1,82 ± 0,12 mm (Tabla 1].

3,2. Efecto de MeDL en tejido niveles de mediadores inflamatorios

La inflamación inducida por la FCA se asoció con un aumento en los niveles de PGE 2 y TNF-α. El tejido niveles de PGE 2 y TNF-α fueron 7,35 ± 0,14 y 71,5 ± 5,00 pg / mg de tejido en la ley de control frente a 1,00 ± 0,01 y 2,50 ± 5,00 pg / mg de tejido en condiciones normales de control de ratas, respectivamente. Ambos MeDL y rofecoxib produce una disminución significativa en los niveles de PGE 2 y TNF-α (P <.005). Los niveles de PGE 2 en MeDL grupo de 500 fueron 0,6 ± 0,05, y en 100 ROfE grupo fueron 1,00 ± 0,23, y que de TNF-α en MeDL grupo de 500 fueron 14,50 ± 15,00, y en 100 ROfE grupo fueron 10,50 ± 5,00 pg / mg de tejido, respectivamente. PBZ por otra parte no era eficaz para reducir el tejido PGE 2 y fue sólo marginalmente eficaces para reducir el tejido TNF-α niveles (Figura 2]. FCA inyección producido un aumento significativo en el tejido MPO actividad de 0,06 ± 0,01 OD / mg de tejido en condiciones normales de control de ratas a 1,33 ± 0,11 OD / mg tejido. El tratamiento con rofecoxib MeDL y redujo significativamente el tejido MPO actividad y su efecto es comparable en este sentido. Los niveles de OPG 0,14 ± 0,02 y 0,09 ± 0 OD / mg de tejido en MeDL 500 y ROfE grupo 100, respectivamente. PBZ por otra parte fue marginalmente efectiva para disminuir los niveles de la OPG en comparación con FCA de control (1,00 ± 0,03 frente a 1,33 ± 0,11 OD / mg tejido) (Figura 2]. MeDL y rofecoxib también se equieffective en la reducción de los niveles de tejidos NO artríticos en las ratas (2,0 ± 0,11 y 2,8 ± 0,10 contra 5,9 ± 0,50 μ M / mg de tejido en el control de FCA). El efecto del PBZ en este sentido es comparable a la de MeDL y rofecoxib (3,0 ± 0,04 μ M / mg de tejido) (Figura 2].

3,3. Efecto de MeDL en tejido niveles de GSH, catalasa, SOD, GPx, y TBARS

El estrés oxidativo asociado con FCA inducida monoarthritis se evaluó midiendo los niveles de GSH, catalasa, SOD, GPx, y TBARS en el conjunto del tejido inflamado. FCA inyección en la articulación del tobillo disminuyó marcadamente el tejido GSH, catalasa, SOD, GPx y los niveles de 18,20 ± 1,10 mg / g de tejido, 28,60 ± 0,15 U / mg de proteína, 277,70 ± 0,15 U / mg de proteína, y 31,40 ± 0,10 U / mg de proteína en el control de ratas normales a 4,80 ± 0,40 mg / g de tejido, 0,17 ± 0,02 U / mg de proteína, 79,90 ± 0,10 U / mg de proteína y 5,97 ± 0,05 U / mg de proteína, respectivamente. Ambos MeDL y rofecoxib produjo un incremento dosis-dependiente en el nivel de estos parámetros de estrés oxidativo. Por otra parte, FCA producido un notable aumento en los niveles de TBARS de 3,50 ± 0,50 nmol / g de tejido a 103,00 ± 3,00 nmol / g de tejido. Ambos MeDL y rofecoxib produjo una dosis-dependiente disminución en los niveles de TBARS y el efecto de estos fármacos fue similar. PBZ, por otra parte, produjo un cambio marginal en los niveles de todos los parámetros de estrés oxidativo en comparación con el control FCA (Cuadro 2].

3,4. Efecto de MeDL conjunta en la histología

La inflamación inducida por la FCA se asoció con la infiltración celular, edema, formación de granulomas y la destrucción ósea en 28 días (Figura 3 (b)].

Ambos MeDL 500 y ROfE 100 disminuyó significativamente los cambios artríticos en comparación con el control de FCA, sin embargo, el rofecoxib fue más eficaz en este sentido (Figuras 3 (c] y 3 (d)].

4. DISCUSIÓN

El látex de Calotropis procera es conocida por sus propiedades anti-inflamatorias en distintos modelos experimentales. También se ha demostrado brindar protección contra el deterioro funcional producido por FCA en ratas modelo de monoarthritis. En el presente estudio, hemos evaluado el efecto de látex de C. procera sobre los niveles de mediadores de la inflamación, estrés oxidativo parámetros, y la histología en conjunto FCA inducida monoarthritis modelo y en comparación con rofecoxib. Intra-articulares de inyección de FCA produjo un pico de respuesta inflamatoria en la articulación en el día 4 que se asocia con exudación de líquido, infiltración de neutrófilos, mastocitos y activación [31, 32]. Esto fue seguido por una lenta regresión y las articulaciones hinchadas continuó hasta el día 28 posiblemente debido a base de aceite adyuvante y el antígeno de Mycobacterium [33]. El efecto inhibidor de la droga fue evaluada frente a FCA inducida por inflamación en el día 4. MeDL produjo un dependiente de la dosis de inhibición de la inflamación en común que puede atribuirse a su capacidad para inhibir la afluencia celular y la permeabilidad vascular [17, 20]. Por lo anterior ha sido demostrado para inhibir la respuesta inflamatoria inducida por diversos mediadores y inflammagens como la histamina, bradicinina, prostaglandinas, carragenin, y compuesto 48/80 [17]. La función de diversos mediadores de la inflamación en adyuvante de la artritis inducida ha sido bien establecida [34, 35]. En nuestro estudio, rofecoxib, un selectivos de la COX-2 inhibidores, fue encontrado para ser más eficaz que la fenilbutazona MeDL y en la inhibición de la FCA-inducida por la inflamación conjunta como se informó anteriormente por Kumar et al. [21] y Francischi et al. [36]. El rofecoxib actúa mediante la inhibición de la COX-2 que juega un papel importante en una reacción inflamatoria. La mayor eficacia de rofecoxib puede atribuirse a su mejor distribución en el sitio de la inflamación como se sugiere para otros inhibidores COX-2 [37]. Además, rofecoxib también se encontró para ser más eficaces en comparación con MeDL en la inhibición de afluencia de células y la destrucción ósea, como puso de manifiesto por el análisis histológico. El efecto inhibidor de MeDL y rofecoxib en células afluencia se fundamenta en su capacidad para disminuir el tejido MPO actividad que se ha utilizado como un índice de infiltración de granulocitos. Es interesante observar que PBZ produjo sólo una disminución marginal en el tejido MPO actividad. La incapacidad de PBZ celular para inhibir la afluencia ha informado también de Meacock y Cocina [38] y Arya y Kumar [17].

La contratación neutrofílica en el lugar de la inflamación se ha informado de la participación de TNF-α producción que induce la síntesis de LTB4, un conocido chemoattractant prostaglandinas y que desempeña un papel clave en la patogénesis de las enfermedades inflamatorias. Niveles elevados de TNF-α y las prostaglandinas han sido reportados en pacientes artríticos y en la artritis inducida experimentalmente [39, 40]. En nuestro estudio, tanto MeDL y rofecoxib produce una marcada reducción en el tejido niveles de TNF-α y PGE 2. Sin embargo, PBZ fue ineficaz para reducir los niveles de PGE 2 a pesar de que produjo una disminución significativa en el tejido TNF-α. Una notable reducción en los niveles de PGE 2 provocada por MeDL es comparable a la de rofecoxib y sugiere que, al igual que el rofecoxib, MeDL podría ser la inhibición de la COX-2. Anteriormente, el MeDL ha demostrado inhibir la inflamación inducida por la PGE 2 [17].

El papel del NO ha sido bien establecida en una reacción inflamatoria. Como la respuesta inflamatoria progresa, grandes cantidades de NO se generan a través de la inducción de iNOS (inducible óxido nítrico sintasa) que reacciona con el anión superóxido para formar peroxynitrate, un potente oxidante molécula capaz de suscitar la peroxidación lipídica. Peroxidación lipídica es el deterioro oxidativo de los lípidos poliinsaturados de forma radical intermedias que dan daño celular. MDA, un importante producto final de esta reacción, es un índice de la peroxidación lipídica y se ha estimado como TBARS [41]. En nuestro estudio, tanto MeDL rofecoxib y derribó el tejido niveles de NO y TBARS. Por otra parte, el infiltrarse en las células también generar especies reactivas del oxígeno y radicales libres que lograr la destrucción de la inflamación articular. Como resultado de ello, la enzima SOD basura que conduce a la formación de peróxido de hidrógeno se utiliza y su actividad se reduce en ratas artríticas. El peróxido de hidrógeno así generado se descompone por la catalasa y la glutatión peroxidasa. El exceso de producción de hidroperóxidos de lípidos también pueden contribuir a la disminución de la actividad de GPx en artríticos condición [42]. Además de enzimáticos antioxidantes, el nivel de glutatión, un agente reductor nonenzymatic trampas que los radicales libres y previene el estrés oxidativo, es también disminuyó en la artritis [43]. Ambos MeDL y rofecoxib mantiene la homeostasis oxidativo, y los niveles de GSH y las actividades de catalasa, SOD y GPx fueron comparables a las de control de animales. Las propiedades antioxidantes de rofecoxib y de látex de C. procera También se ha informado anteriormente [44, 45].

Por lo tanto, el presente estudio muestra que el látex de C. procera reduce notablemente el flujo de células, liberación de mediadores, y el estrés oxidativo asociado con artritis condición, y, por tanto, tiene el potencial de ser utilizado como un agente antiarthritic.