Mediators of Inflammation, 2007; 2007: (más artículos en esta revista)

El aumento de la endotelina-1 Niveles de BAL de fluidos en pacientes con Enfermedad de Behçet

Hindawi Publishing Corporation
Kamel Hamzaoui [1], Hanene Chelbi [1], Mariam Kamoun [1], Imen Ben Dhifallah [1], Agnes Hamzaoui [1, 2]

Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que la obra original esté debidamente citados.

Resumen

Objetivo y antecedentes. Aneurismas de la arteria pulmonar trombosis constituyen una causa importante de morbilidad y mortalidad en la enfermedad de Behçet (EB). Diversos factores se han estudiado para explorar la patogénesis de la participación vascular en BD. Como la endotelina (ET) es conocido por su potente vasoconstrictor y propiedades proinflamatorias, que supone que está involucrado en el proceso inflamatorio de BD vasculitis pulmonar. Métodos. Para investigar el papel de las ET en BD, ET-1 se midieron las concentraciones en el lavado broncoalveolar (BALF), de 18 de no fumar BD pacientes con manifestaciones pulmonares y 12 sujetos control. Inmunoreactividad de ET-1 fue también evaluado en los macrófagos alveolares (AMS) citoplasma. Resultados. ET-1 en los niveles BD-BALF fueron significativamente más altos que los de los controles. ET-1 los niveles se correlacionaron con el número de macrófagos alveolares, pero no con relación BAL-CD4/CD8. ET-1-inmunoreactividad se encontró principalmente en AM de BD-BAL. Conclusiones. El aumento de ET-1 AM de la producción se asocia con manifestaciones pulmonares BD.

1. INTRODUCCIÓN

La enfermedad de Behçet (EB) es una enfermedad multisistémica inflamatoria caracterizada por úlceras recurrentes orales, úlceras genitales, inflamación ocular y, ya menudo las articulaciones, piel, tracto gastrointestinal, sistema nervioso central (SNC), pulmonar y manifestaciones [1 - 3]. BD es reconocida como una vasculitis multisistémica, que puede afectar a todos los tipos de vasos sanguíneos [1]. En el curso de BD, 25-37% de pacientes desarrollan complicaciones vasculares [1 - 4].

La evidencia reciente sugiere que ET debe ser considerada como un mediador inflamatorio [5, 6], y puede estimular los macrófagos y monocitos a la liberación de citoquinas proinflamatorias. Los datos recientes también se indica que la disfunción endotelial (DE) es una característica constante de BD [7]. Etiología de ED en BD es probablemente multifactorial. La activación de ambos innata y de tipo Th1 la respuesta inmune adaptativa con una mayor expresión de citoquinas proinflamatorias, moléculas de adhesión, radicales libres de oxígeno [8], y niveles altos de homocisteína [7] se han sugerido responsables de la activación de células endoteliales, independientemente de manifiesto vascular manifestaciones. Salas et al. [9] observó un aumento de la FA (la arteria braquial mediada por flujo dependiente del endotelio dilatación) los valores siguientes administración de vitamina C en 12 pacientes, sugiriendo un papel importante de estrés oxidativo en la disfunción endotelial en BD. Microambiente inflamatorio en BD puede causar reducción de la biodisponibilidad de óxido nítrico a través de citoquinas proinflamatorias, así como una mayor oxidado los niveles de colesterol LDL [10, 11].

ET tiene mitogénica y proliferativa acciones en fibroblastos [12] in vitro y es producida por muchos tipos de células pulmonares, como las células endoteliales [13], las células epiteliales [14] y los macrófagos [6]. Curiosamente, un estudio reciente utilizando humanos ET-1 ratones transgénicos ha demostrado que pulmonar ET-1 sobreexpresión causa fibrosis pulmonar [15]. ET-1 induce la fibronectina también expresión en el epitelio bronquial humano a través de un receptor de ETA [16], lo que sugiere una contribución de ET-1 como los intermedios patogénesis de la fibrosis porque fibronectina es un potente chemotactic factor de fibroblastos [16].

Sobre este telón de fondo, nuestro estudio ha sido planificada para evaluar la contribución de ET bioactivos a la BD manifestaciones pulmonares. Con este fin, ET concentración en BALF BD de los pacientes se midió en BAL BD activa de pacientes con manifestaciones pulmonares.

2. MATERIAL Y MÉTODOS
2,1. Los pacientes

Se estudiaron 18 pacientes activos BD (12 hombres y 6 mujeres; los pacientes que no fuman, con una edad media: 49,8 años, rango: 28-52 años). La selección se hizo sobre la base de los criterios definidos por el Grupo Internacional de Estudio para el diagnóstico de enfermedad de Behçet [17]. Características clínicas de los pacientes con una activa etapa figuran en el cuadro 1, que describen la carga global de la enfermedad en las manifestaciones BD pacientes. Todos los activos BD pacientes tienen manifestaciones pulmonares. Active BD pacientes fueron siempre tratados con colchicina y esteroides. El control de los sujetos consistió de 12 de los no fumadores (cinco hombres y siete mujeres, con una edad media: 46,2 años, rango: 32-48 años) en las investigaciones de rutina para la sospecha de carcinoma bronquial y cuya radiografía de tórax (RxTx), examen bronquial, pulmonar y funciones fueron normales. Ninguno de ellos había evidencia de infección aguda o crónica enfermedad (por ejemplo, otros autoinmune atópica o trastornos). El consentimiento informado se obtuvo de todos los pacientes y sujetos control. El diseño del estudio fue aprobado por nuestro Comité Nacional de Ética.

2,2. Lavado broncoalveolar

La broncoscopia se realizó de acuerdo a las directrices estándar, tal como se describe anteriormente [18]. Treinta minutos antes de que el procedimiento los pacientes recibieron 0,5 mg de atropina y 12,5 mg de codeína por vía intramuscular. Anestesia local de la orofaringe se logró por Novesine spray (Wander, Suiza) hasta el gag reflejos amainado. La broncoscopia se realizó con un broncoscopio Pentax a través de los cuales 150 ml de solución salina normal prewarmed en alícuotas de 20 ml se inculca en un subsegmento del lóbulo medio derecho. BAL líquido inmediatamente después fue aspirado por el lado de succión suave en tubos de plástico y se mantiene a 4 ° C en hielo.

2,3. Procesamiento de células BAL

BAL muestras fueron filtradas a través de una capa de dos gasa estéril en frascos estériles de plástico (Falcon, Oxnard, CA, EE.UU.), se centrifuga a 4 º C y 500 gramos durante 10 minutos. El sobrenadante fue removido y las células fueron lavadas dos veces en PBS. El número total de células se había contado utilizando un hemocitómetro Neubauer (Brand, Wertheim, Alemania). Diferencial de células se realizaron después de la tinción de Giemsa (Merck, Darmstadt, Alemania), de células frotis con 1000 células por diapositiva contados.

2,4. Análisis de linfocitos T en subconjuntos BAL

BAL células fueron incubadas en presencia de saturar las concentraciones de fluoresceína conjugado con AcMo contra la superficie marcadores CD3, CD4 y CD8 y isotipo con ajuste de control de anticuerpos etiquetados con FITC, PE, y PE/CY5 (obtenida a partir de Dako, Hamburgo, Alemania) durante 20 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Inespecíficos fluorescencia fue detectada por incubando ratón IgG del mismo isotipo, pero con especificidad de antígenos irrelevantes. Después de dos lavados con PBS, las células fueron analizadas por citometría de flujo (FACScan, Becton Dickinson, Heidelberg, Alemania).

2,5. La extracción de ET y de inmunoensayo enzimático

Los niveles de endotelina en BALF fueron evaluados según lo descrito anteriormente [19]. En pocas palabras, BALF la muestra (5 mL, descongelado a 4 ° C) se cargaron en sep-Pak columna C18 (Millipore, Milford, MA, EE.UU.) que había sido preactivated de metanol, y lavarse con el 0,1% de ácido trifluoroacético. Encuadernación ET se eluye con metanol: agua: ácido trifluoroacético (90: 10: 0,1) y se evaporó por centrífuga congelación de pelo. El pellet resultante se reconstituyó con 500 μ l de buffer de ensayo y, a continuación, la concentración de ET extraído se midió utilizando la endotelina kit de inmunoensayo enzimático (I + D Sistema de Europa, Ltd, Abingdon Science Park, Reino Unido). El límite de detección del ensayo fue de 0,78 pg / mL.

2,6. La inmunocitoquímica

BAL células fueron centrifugadas a 300 g durante 10 minutos. Las diapositivas fueron secadas al aire y fijadas en acetona. BAL células fueron teñidas con conejo MAB para la ET-1 (BIOTREND productos químicos GmbH; Köln, Alemania), utilizando la etiqueta de anticuerpos método (método indirecto). Las diapositivas fueron incubadas durante 1 hora a 37 ° C con 1 / 200 de dilución de conejo MAB para la ET-1, y se incubaron con peroxidasa de rábano, la etiqueta de cabra anti-IgG de conejo por un nuevo 1 hora a 37 ° C. Peroxidasa fue visualizado por incubando diapositivas en 3,3 '-Diaminobencidina tetraclorhidrato y peróxido de hidrógeno ( H 2 O 2 ) Durante 2 minutos.

2,7. La medición de la albúmina

La concentración de albúmina en BALF se midió por ELISA kit (Exocell, Filadelfia, PA, EE.UU.). El ensayo siguió un formato convencional de ELISA, utilizando un anticuerpo que reconoce el antígeno (albúmina) en las muestras de ensayo.

2,8. El análisis estadístico

Los datos se presentan como media ± SE. Comparación de la ET-1 en los niveles BALF entre sujetos normales y activas BD pacientes se realizó mediante la prueba t de Student para muestras apareadas. Las correlaciones fueron probados mediante el cálculo de Pearson del coeficiente de correlación (r). Los cálculos se realizaron con el SPSS (10,0). Valores de P <.05 fueron considerados estadísticamente significativos.

3. RESULTADOS
3,1. BAL diferencial de células y relación CD4/CD8

BALF recuperación de los volúmenes no fueron diferentes entre los activos BD y controles sanos (52,7 ± 9,6% frente a 53,4 ± 10,2%, P = .38). El BAL células tienden a ser mayores en activo BD de controles sanos, pero no alcanzó significación estadística (Tabla 2]. El porcentaje de linfocitos fue mayor en activo BD-BAL que en los sujetos control [(28,7 ± 10,2%) frente a (16,3 ± 8,5%), p = .0002]. El porcentaje de 12 macrófagos no fue significativamente diferente entre el activo y BD controles sanos [(68,7 ± 8,4%) frente a (72,4 ± 10,7%); P = .08]. No se observaron diferencias en los porcentajes de los neutrófilos y eosinófilos.

El porcentaje de linfocitos CD4 + en BAL de los pacientes con BD activa (68,7% ± 12,3%) fue superior a la de los controles normales (52,7% ± 18,5%, P = .037). El ratio CD4/CD8, en pacientes con BD activa (2,26 ± 0,8), aumentó significativamente en comparación a controles sanos (1,16 ± 0,3, p = .041).

3,2. ET-1 en los niveles BALF

Endotelina-1 en los niveles de BALF activa BD fueron significativamente mayores en activo BD de que los controles sanos (22,78 frente a 7,23 ng / mg de albúmina, P <.004) (Figura 1].

3,3. Correlación entre la ET-1 de concentración y el número de macrófagos alveolares (AMS) en BALF

Hubo una correlación positiva (r = .56, P = .014) entre el número de macrófagos y ET-1 en los niveles BALF (Figura 2]. No hay correlación (r = .08, P = .734) entre el ET-1 y los niveles de CD4/CD8 ratio (Figura 3].

3,4. La inmunocitoquímica de ET-1

El BALF citoplasma de las células de pacientes con BD se activa fuertemente teñidas con anti-ET-1, en comparación a controles sanos. La mayoría de las células teñidas en activo se BD macro-fagos (Figura 4]. El porcentaje de acompañamiento immunopositive de ET-1 se evaluó en cinco campos y de todos los macrófagos se immunopositive de ET-1 en activo BD BAL (84,77 ± 12,49%), mientras que <2% fueron teñidas en forma positiva los controles sanos (Tabla 2]. Cuando los macrófagos se incubaron durante 24 horas sin la estimulación, medios de cultivo en activo BD figura niveles más elevados de ET-1 que para los controles sanos.

4. DISCUSIÓN

Pulmonar manifestación en BD es una de las principales causas de muerte. La supervivencia media tras el inicio de hemoptisis se informó de que alrededor de 10 meses [20, 21]. Los últimos informes de elevación de las concentraciones séricas del factor de von Willebrand, inhibidor del activador del plasminógeno-1, y thrombomodulin sugieren que la alteración del endotelio vascular función contribuye a la patología vascular en BD [22]. Endotelio-independiente vasodilatación (EIVD) resultó ser baja en los pacientes con BD [7].

La fuente de ET-1 en el pulmón ha sido controvertida. En el pulmón normal, ET-1 es conocido por ser producida por varias células pulmonares, como las células endoteliales, células epiteliales, y AM [5]. El aumento de expresión de inmunorreactiva ET-1 y ET-1 mRNA en condiciones patológicas pulmonares incluyendo manifestaciones se ha demostrado en AM y la proliferación de células epiteliales alveolares [5, 23].

En este estudio, una correlación significativa se observó entre la ET-1 y la concentración del número de AM. Un aumento de la presencia de inmunorreactiva ET-1 en el citoplasma de AM de BD pacientes, pero no controles sanos fue revelado por inmuno ensayo. Estos datos sugieren que ET-1 puede desempeñar un papel importante en las manifestaciones inflamatorias de pulmón en estos pacientes.

Una variedad de mediadores, que podrían estar involucrados en la patogénesis de la intermedia inflamación pulmonar en pacientes BD, se ha estudiado. Citoquinas proinflamatorias como TNF-α, IFN-γ, IL-1, IL-6, IL-8, e IL-18 se sabe que amplifican la respuesta inflamatoria en BD [18, 24 - 26]. Proteína inhibidora de macrófagos-1 α (MIP-1 α), un C-C de quimioquinas, que estimula la activación y migración de leucocitos, se encontró elevado en los pacientes con BD, y se correlaciona con la IL-8, RANTES, MCP y niveles-1 [27]. La expresión de ET-1 mRNA se incrementó después de una incubación con α - (IL-8 y MGSA / Gro α) y β-quimiocinas (MCP-1, MIP-1 α, MIP-1 β, y RANTES), y una mezcla 3 de citoquinas proinflamatorias TNF-α, IL-1 β, y IFN-γ fue capaz de aumentar la expresión de mRNA ET-1 [28]. Estos datos proporcionan varias conclusiones, la más importante de los cuales es un estimulante papel de las quimiocinas en el endotelio vascular. Nuestros datos apoyan una producción local de ET-1 en los alvéolos pulmonares. En nuestro estudio, la mayoría de las medidas de acompañamiento expresado intracitoplasmática de ET-1. Este hallazgo podría estar vinculado con la polarización de los linfocitos T hacia los de tipo Th1 en BD citocinas Th1 como promover la aceleración de la función de los macrófagos. Por otra parte BAL líquido células de los pacientes con EB tienen una mayor expresión de mRNA IFN-γ e IL-18 en comparación con los controles normales [18, 29]. De la misma manera, TNF-α aumenta la expresión de ET-1 en células epiteliales bronquiales, y TNF-α en libertad es de por sí un aumento de ET-1 [30]. Como cuestión de hecho, los altos de TNF-α niveles se han observado en BD sueros, correlacionó positivamente con la IL-18 de producción [31, 32].

La interacción entre ET y diversas citoquinas pueden regular / exacerbar los eventos patológicos en las manifestaciones pulmonares en BD. ET-1 se ha puesto en marcha como un importante mediador en los bronquios [33]. En estudios con animales, el aumento de ET-1 mRNA nivel en tejido pulmonar precedió al aumento en los niveles de mRNA de TNF-α, IL-1 β, e IL-8. El tratamiento de los animales con el antagonista del receptor de ET bosentan traducido en una reducción sustancial en las concentraciones de TNF-α, IL-1 β, el interferón-γ, y ET-1 en BAL fluido [33]. En BD, la interacción entre la ET-1 proinflamatorias y mediadores debe ser dilucidado.

Disfunción del endotelio vascular es un evento central en la patogénesis de una variedad de enfermedades humanas, incluidas las de adultos el síndrome de dificultad respiratoria, arteriosclerosis, difusa y los trastornos inflamatorios sistémicos [34]. Lesión endotelial parece inducir a una disfunción en el óxido nítrico (ENOS; iNOS) actividad, resultando en un entorno proinflamatorias en asociación con daño tisular [34]. Recientemente, se ha informado también de que la reducción de plasma de óxido nítrico (NO) en los niveles BD pacientes están implicados en el desarrollo de las endoteliales y anomalías que ocurren complicaciones trombóticas en estos pacientes [35]. Un deterioro del dependiente del endotelio, mediada por flujo de dilatación se ha descrito en BD sugiriendo una disminución de la actividad NO endotelial, que puede contribuir a lesiones vasculares en BD. Sin embargo, ha habido informes contradictorios sobre las concentraciones de NO suero en pacientes con BD [36]. Recientemente, endotelial de óxido nítrico sintasa polimorfismo Glu298Asp gen se asoció significativamente con BD en un grupo seleccionado al azar de turco los pacientes [37]. Los autores examinaron el hecho de que, con respecto a los problemas de la producción, la asociación significativa del polimorfismo Glu298Asp con BD puede tener una implicación clínica, ya que el polimorfismo de proteínas genera productos con diferentes susceptibilidad a la división. Discutieron el hecho de que esto podría haber contribuido a anormalmente bajo ninguna generación. La combinación de los efectos paracrinos de ET-1, junto con la liberación de NO es probable que tenga un importante papel fisiológico en la regulación del flujo sanguíneo, como ET-1 y NO tienen efectos opuestos. ET-1 induce la vasoconstricción y trombosis ocular que contribuyen a las manifestaciones patológicas y promover la retina nonperfusion capilar y la isquemia [38]. El aumento de los niveles de VEGF y MCP-1 detectado en BD trombosis sugieren el posible papel de estas citoquinas angiogénicos junto con ET-1 en la patogénesis de la enfermedad. Por otra parte, ET-1 ha mitogénica propiedades, con los estudios en animales que indican una función en la proliferación de cultivos de las vías respiratorias células musculares lisas y células epiteliales las vías respiratorias. La presencia de endotelina-1 en una mayor concentración de diversidad biológica en los pacientes pulmones sugiere que una investigación más a fondo de su papel en la remodelación de los vasos pulmonares se justifica y posibles interacciones de la endotelina-1 con otros factores de crecimiento en BD aún no se han aclarado.

Este estudio fue apoyado por la concesión de "Ministère de l'Enseñanza Supérieur et de la Recherche de Túnez; DGRST." Autores quiero dar las gracias al Dr Mohamed Chahed para el análisis estadístico (Departamento de Medicina Preventiva).