Journal of Burns and Wounds, 2007; 6: (más artículos en esta revista)

Ácido hipocloroso como un posible agente de cuidado de heridas

Abrir las ciencias Company, LLC
Wang L [a], M Bassiri [a], R Najafi [a], Najafi K [b], Yang J [a], B Khosrovi [a], W Hwong [a], E Barati [a], B Belisle [A], C Celeri [a], Robson MC [c]
[a] NovaBay Pharmaceuticals, Inc, Emeryville, CA
[b] Eye Institute de San Rafael, CA
[c] Instituto para la regeneración de tejido, Reparación y Rehabilitación, Bay Pines, FL

Se trata de un acceso abierto mediante el cual el artículo los autores conservan los derechos de autor de la obra. El artículo se distribuye bajo la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que la obra original esté debidamente citados.

Resumen

Objetivo: ácido hipocloroso (HOCl), uno de los principales compuestos inorgánicos bactericida de inmunidad innata, es eficaz contra una amplia gama de microorganismos. Debido a su naturaleza química, HOCl nunca ha sido utilizado como un producto farmacéutico para el tratamiento de la infección. En este artículo se describe la fabricación de productos químicos, de estabilización, y la actividad biológica de un pharmaceutically útil formulación de HOCl. Métodos: HOCl es estabilizada en la forma de una solución equilibrada fisiológicamente en solución salina al 0,9% en un rango de pH de 3,5 a 4,0. El cloro distribución de especies en solución es una función del pH. En solución acuosa, HOCl es la especie predominante en el rango de pH de 3 a 6. En valores de pH inferior a 3,5, la solución existe como una mezcla de cloro en fase acuosa, cloro gas, tricloruro (Cl 3 -), y HOCl. A pH superior a 5,5, el hipoclorito de sodio (NaOCl) comienza a forma y se convierte en la especie predominante en el pH alcalino. Para mantener HOCl solución en una forma estable, maximizar sus actividades de los antimicrobianos, y reducir al mínimo los productos secundarios indeseables, el pH debe mantenerse en un 3,5 a 5. Resultados: El uso de este estabilizado forma de HOCl, la potente actividad antimicrobiana de HOCl se manifestaron contra una amplia gama de microorganismos. La citotoxicidad in vitro perfil en células L929 y vivo en el perfil de seguridad de HOCl en varios modelos animales se describen. Conclusión: Sobre la base de la actividad antimicrobiana y la falta de toxicidad animal, se prevé que HOCl ha estabilizado potencial en aplicaciones farmacéuticas el control de la infección de tejidos blandos.

Una característica notable del sistema inmune es su capacidad para poner en marcha una respuesta eficaz contra los patógenos invasores mediante el despliegue de un grupo de productos químicos altamente reactivos, incluidos los oxidados halógenos, los radicales oxidantes, y el oxígeno singlete. 1, 2

Como se muestra en la Figura 1, el precursor de estas especies reactivas del oxígeno (ROS) es el radical de oxígeno (O 2), que es generada por células inmunes especializadas de neutrófilos, eosinófilos, fagocitos mononucleares y los linfocitos B. 1 - 9 de producción de ROS en estas células se acompaña de un aumento significativo en el consumo de oxígeno, una serie de eventos a que se refiere colectivamente como la ruptura oxidativa. La principal enzima responsable de la producción de ROS es una membrana mitocondrial-determinada enzima conocida como respiratorias ráfaga NADPH oxidasa. 1 Los pacientes con enfermedad granulomatosa crónica oxidasa tienen genes defectuosos, lo que los hace susceptibles a la infección repetida. 10, 11 Durante una ráfaga respiratorias, los neutrófilos producir H 2 O 2, que se convierte en HOCl de la actividad de la enzima gránulo myeloperoxidase en la siguiente reacción. 12

HOCl es conocido por ser el principal fuerte oxidante producida por los neutrófilos y es un potente agente microbicida dentro de estas células. 2, 10 Experimentalmente, se ha estimado que 10 6 neutrófilos estimulados in vitro puede producir 0,1 μ M HOCl. Esta cantidad de HOCl puede matar a 1,5 × 10 7 Escherichia coli en menos de 5 minutos 13. HOCl reacciona fácilmente con una variedad de moléculas biológicas, en particular los que tienen tiol, thiolether, hemo proteínas, aminoácidos y grupos, 12 y puede dar lugar a daño tisular . Taurina, un aminoácido nonessential naturalmente encontrados en aproximadamente el 15 mM dentro de los neutrófilos actúa como una molécula scavenger para HOCl a través del siguiente mecanismo, y efectivamente reduce los daños colaterales a las macromoléculas celulares causados por HOCl 14.

Hasta la fecha, puro HOCl no se ha desarrollado como una fórmula farmacéutica comercial, presumiblemente a causa del reto de mantener la estabilidad de almacenamiento. En este artículo se describe un método para la preparación y la estabilización de una forma pura de HOCl (conocida también como la NVC-101) para su posible uso como agente farmacéutico. Mostramos aquí que si se compara con los desinfectantes disponibles comercialmente peróxido de hidrógeno y el hipoclorito de sodio (NaOCl), esta formulación ha mejorado in vitro y actividad antimicrobiana índice terapéutico. Por otra parte, presentamos datos que demuestran un excelente perfil de seguridad para NVC-101 animales en estudios de toxicología. Creemos que la mejora de las propiedades de nuestro puro estabilizado fisiológicamente equilibrada forma de HOCl puede permitir su uso en una situación clínica como en el tratamiento o prevención de la infección o quemadura en otras heridas.

MATERIAL Y MÉTODOS
Preparación de HOCl

Grado reactivo NaOCl fue adquirido de JT Baker. Ácido hipocloroso se preparó en NaCl 154 mM de acidificación de grado reactivo NaOCl al rango de pH de 3,5 a 4,0 con HCl diluido. Un pH-metro Beckman se utilizó para medir con precisión los valores de pH final. La concentración de cloro activo total de especies en solución, expresado en [HOCl] T (donde [HOCl] T = [HOCl] + [Cl 2] + [Cl 3 -] + [OCl -]) en solución salina al 0,9% fue determinado mediante la conversión todas las especies de cloro activo a OCl - con 0,1 M de NaOH y la medición de la concentración de OCl -. La concentración de OCl - se determinó espectrofotométricamente a 292 nm (ε = 362 M - 1 cm - 1) 15 con una Agilent 8453 UV-visible espectrofotómetro.

Materiales microbiológicos

Todos los microorganismos utilizados en estos estudios fueron comprados de la American Type Culture Collection (ATCC), crecido y se propaga de acuerdo con las recomendaciones para cada cepa de ATCC. Células bacterianas fueron cosechadas en fase estacionaria y se determinaron las concentraciones de 10 veces la dilución directa de colonias. Para la preparación del inóculo, las bacterias se diluye en solución salina estéril antes de su uso para minimizar el efecto de caldo en HOCl.

Concentración bactericida mínima

Una modificación del Comité Nacional de Consenso sobre protocolo de laboratorio "Métodos para la dilución pruebas de susceptibilidad antimicrobiana de bacterias que crecen aerobiamente" fue utilizada en estos estudios. Estéril 0,9% de solución salina a pH 3,5 a 4,0 (vehículo) fue utilizado como diluyente. El uso de este tipo permite a un diluyente para la determinación de la actividad intrínseca de HOCl en ausencia de cualquier interferencia moléculas. Concretamente, cada artículo de la prueba se diluye utilizando 2 veces serie de dilución en ácido lavado con tubos de vidrio para dar un rango de concentraciones de aproximadamente 2 a 0,002 mm en un volumen final de 1 mL. Cada dilución se inoculará con 5 × 10 5 UFC / ml de prueba coincubations bacterias y se llevaron a cabo a temperatura ambiente durante 60 minutos. A los 60 minutos posttreatment, 0,1 mL de cada reacción fue trasladado de inmediato en prelabeled de 1,5 ml que contienen tubos de microfuga de 0,9 ml y Engley Dey (D / E) neutralizador de caldo (de diagnóstico Hardy, Santa Maria, CA). Concentración bactericida mínima (MBC) se determina en placas de 0,1 mL de cada muestra en una placa de agar. Las placas fueron incubadas durante la noche a 35 ° C, y para examinar el crecimiento de colonias. La concentración en la que hubo una total ausencia de colonias de crecimiento se determina que el CBM. Comparado CBM resultados proporcionan estimaciones de la susceptibilidad de varios artículos de prueba contra los organismos de prueba.

Tiempo de matar

Para matar el tiempo de estudios, 5 mL de artículo de la prueba en una concentración aproximada CBM se inoculó con aproximadamente 10 6 UFC / ml de cada organismo de prueba y se incubarán durante 0, 5, 10, 15, 20, 30, 60, y 90 minutos en la sala la temperatura. Para cada punto del tiempo, 0,1 mL fue transferido en 0,9 mL de D / E neutralizador caldo y 0,1 ml de esta mezcla fue incubada chapada y como se describe anteriormente.

Citotoxicidad

L929 (ATCC CCL-1, NCTC clon 929) es un tejido conectivo de las células derivadas de la línea normal subcutánea areolar y el tejido adiposo de 100 días de edad de sexo masculino ratón C3H. L929 células fueron adquiridos de ATCC y propagadas de acuerdo con las recomendaciones del proveedor. Estas células fueron sembradas a 1,5 × 10 4 células por pocillo en placas de 96 pocillos y se incuba durante la noche a 37 ° C. En el día de la prueba, el crecimiento medio fue aspirado de cada bien, y 30 μ l nuevo medio se añadió por pocillo. Prueba de artículos se diluye por 2 veces en serie de dilución utilizando solución salina 154 mM en el pH deseado para cada artículo de la prueba. A raíz de que, 170 μ l de cada dilución se añadió a cada pocillo para un volumen total de 200 μ l por pocillo. Después de 60 minutos de exposición a 37 ° C, prueba de los artículos fueron sustituidos con 200 μ l de cultivo de tejidos frescos y los medios de comunicación se incubaron durante 24 horas a 37 ° C. Célula de viabilidad se determinó mediante la adición de WST-8 (Dojindo, Japón) y el reactivo de absorción a 450 nm lee por espectrofotometría. Rojo-naranja formazan, que es producida por células vivas, es una medida directa de la viabilidad celular en este ensayo.

Índice terapéutico

El índice terapéutico de un agente antimicrobiano se define como el cociente entre la concentración para alcanzar el 50% de células de toxicidad (CT 50) a CBM.

Animal de seguridad y los estudios de toxicidad

Irritación ocular, la sensibilización de la piel, la toxicología y la herida se han realizado estudios. Un preliminar (no las buenas prácticas de laboratorio [no-BPL]) con un estudio de desarrollo formulación de HOCl (2,5 mM; 0,013% w / v) se llevó a cabo en el Brookdale Eye Clinic (K. Najafi, MD, datos no publicados). Holandés pigmentadas conejos recibieron 5% oftálmica yodo-povidona (Betadine) (15 ojos) o la formulación de desarrollo (15 ojos). Cada ojo recibió 0,1 mL de solución cada 8 horas para un total de 72 horas y se hicieron observaciones periódicas durante este tiempo. El efecto de la formulación de desarrollo se comparó con el 5% de grado oftálmico-Betadine.

A las buenas prácticas de laboratorio estudio de irritación ocular (NAMSA, Toledo, OH) fue diseñado para determinar el potencial de irritación ocular tras una única instilación en el conejo. Nueva Zelanda Blanco conejos (5 por grupo) fueron utilizados. Ácido hipocloroso (NVC-101) fue inculcado en el ojo derecho a concentraciones del 0,01%, 0,03%, y 0,1% w / v (pH 3.5). La izquierda ojos se utilizaron como los controles y no se trata, vehículo (solución salina) o tratados de control positivo. En todos los casos, el volumen utilizado fue de 0,1 mL, que fue colocado en el saco conjuntival inferior. Las evaluaciones para la irritación se hicieron a las 24, 48 y 72 horas. A las 24 horas, la córnea se examinó mediante la tinción con fluoresceína.

BPL repetir dosis herida estudios de toxicidad (Charles River, Spencerville, OH) fueron diseñados para proporcionar la máxima exposición al espesor total heridas en ratas y mini-cerdos. Las heridas fueron tratados con NVC-101 en concentraciones de 0,01%, 0,03%, y 0,1% w / v (pH 3.5). El material de ensayo se aplicó a los heridos zona directamente utilizando gasa empapada. El sitio fue tratada cubiertos por aproximadamente 24 horas por día durante 28 días. Heridas alcanzar el 75% de cierre se mantienen abiertas por la abrasión. Los parámetros utilizados para evaluar la toxicidad sistémica incluyen signos clínicos (incluidas las observaciones del sitio), el peso, la ingesta de alimentos, química clínica (sangre y orina), hematología, peso de los órganos, y las graves y microscópico del tejido evaluaciones.

RESULTADOS
Síntesis de ácido hipocloroso

Ácido hipocloroso puede ser sintetizado por uno de los 3 métodos: hidrólisis de gas de cloro (eq 1], la electrólisis de solución de sal (NCA 2a y 2b], y la acidificación de hipoclorito (eq 3].

Las limitaciones de utilizar la ecuación 1 son los peligros inherentes a la manipulación de cloro y la dificultad de manipulación. La desventaja del método de electrólisis (eq 2) es la dificultad en el control de la concentración objetivo de solución. Desde hipoclorito está comercialmente disponible, la utilización de este método en la ecuación 3 es el método preferido y es más conveniente, seguro y controlable si se compara con los otros 2 métodos.

La distribución de especies cloro activo

En esta sección se analiza la distribución de cloro activo de las especies en función del pH fisiológicamente en solución salina balanceada. La presencia de Cl - en HOCl solución podría dar lugar a la formación de Cl 2 y Cl 3 -. La formación de Cl 2 tiene un impacto significativo sobre la estabilidad de HOCl (Fig 2].

Ecuaciones de 4 a 7 muestran los equilibrios existentes en HOCl/NaC1 solución.

El porcentaje molar de cada especie en fisiológicamente equilibrada HOCl solución es una función del pH (Fig 2]. Como se muestra en la ecuación 5, bajo pH y alta [Cl -] favorece la formación de Cl 2. Una vez Cl 2 está formado en la fase acuosa, que migra en la cabeza para alcanzar el equilibrio a la ecuación 7. La transferencia de Cl 2 de la solución a la cabeza del contenedor se traduce en una disminución en la concentración de cloro activo en solución. Por lo tanto, la desgasificación de Cl 2 se convierte en un importante camino por la pérdida de HOCl en un sistema abierto (nonsealed). Se trata de un problema potencial para el uso clínico de HOCl. Para estabilizar la fisiológicamente HOCl solución equilibrada, minimizando la formación de Cl 2 es esencial. La Figura 2 muestra la distribución de especies cloro en función del pH, de conformidad con el equilibrio mostrado en las ecuaciones 4 a 7. Las líneas son los valores calculados sobre la base de las constantes de equilibrio se muestra en las ecuaciones 4 a 7. 16 - 19

Microbicida efecto de HOCl

Estabilizado HOCl demuestra un amplio espectro de actividad antimicrobiana en concentraciones que van desde 0,1 a 2,8 μ g / ml (Tabla 1].

La excepción es Aspergillus niger, que exigen una mayor concentartion de HOCl (86,6 μ g / mL) fue necesaria para crear un verdadero asesinato del organismo en las mismas condiciones de ensayo. El resumen general de CBM resultados contra diversos microorganismos se muestra en la Tabla 1. Del mismo modo, las diferencias de sensibilidad entre HOCl diferentes bacterias se han comunicado con anterioridad. 20 - 22

Tiempo de matar

Tiempo de matar es una medida in vitro de forma rápida un determinado antimicrobiano puede matar las bacterias de prueba. La tasa de muerte por estabilizado HOCl fue demostrado en el CBM valores para cada microorganismo utilizando un tamaño del inóculo de 1 × 10 6 ml -1 para cada prueba las bacterias (Cuadros 2 y 3]. Como se muestra en este cuadro, la mayoría de los organismos de prueba fueron asesinados (> 99,99%) dentro de los primeros 2 minutos de exposición. Entre las especies bacterianas a prueba, Streptococcus pyogenes 49399 fue la única excepción, que requiere aproximadamente 10 minutos de exposición para la eficacia de las matanzas, en las mismas condiciones de ensayo. El asesinato se estabilizó la tasa de HOCl con NaOCl y H 2 O 2 se determinó entonces contra 3 prueba específica de los organismos E. coli 25922, 27853 P. aeruginosa y S. aureus 29213-a temperatura ambiente durante un total de 90 miniutes.

Cabe mencionar que todos estos estudios matar el tiempo también se realiza con un inóculo tamaño de 1 × 10 7 / mL para cada prueba las bacterias, y los resultados comparativos se muestran en la Tabla 4.

Como los resultados muestran, en su HOCl CBM valores para los distintos organismos de prueba (5.6-12.5 μ M) fue capaz de matar todas las bacterias 3 prueba en menos de 1 minuto, sin matar bacterias importantes efectos a partir de su excipiente, solución salina a pH 4.0 (datos no se muestra). Sin embargo, el tiempo para matar a NaOCl CBM valores de 10 a 50 μ M variados de 5 a 15 minutos para la misma prueba de 3 organismos. En contraste, H 2 O 2 es sólo capaz de matar p. aeruginosa 27853 a 7500 μ M en unos 10 minutos, pero no matar S. aureus 29213, en su mayor concentración probada (20000 μ M), incluso hasta 90 minutos de tiempo de exposición en las mismas condiciones de ensayo (Fig. 3].

Comparativo de células toxicidad

La toxicidad relativa de células de HOCl, NaOCl, y H 2 O 2 se evaluó según un método estándar utilizado para examinar la citotoxicidad de líquidos desinfectantes. 23 El presente ensayo de toxicidad utiliza una línea celular adherente, L929, y el punto final es relativa viabilidad celular medido mediante la adición de WST-8 (Dojindo, Japón) de reactivos colorimétricos. Rojo-naranja formazan, que es producida por células vivas, es una medida directa de la viabilidad celular en este ensayo. La citotoxicidad se midió utilizando 2-diluciones de HOCl, NaOCl, y H 2 O 2 en comparación con los no tratados o tratados con vehículo de control de las células L929. El TC 50 se calculó para cada artículo de la prueba, los valores que se muestran en la Figura 4. El CT 50 los valores de HOCl (15-25 μ g / mL) y NaOCl (38-42 μ g / ml) fueron reproducibles y acompañado de cerca los resultados publicados por NaOCl 16. Sin embargo, la TC 50 valores de H 2 O 2 fueron más variables ( 5-35 μ g / ml), probablemente debido a la inestabilidad química de H 2 O 2 en estas condiciones de ensayo.

Relativo índice terapéutico

La terapéutica índices de HOCl, NaOCl, y H 2 O 2 se evaluaron utilizando células L929 y 3 clínicamente relevantes cepas bacterianas de E. 25922 coli, P. 27853 aeruginosa y S. aureus 29213. El índice terapéutico calculado los valores de los 3 organismos se resumen en la Figura 5.

El valor de estabilizado HOCl es aproximadamente 98 veces mayor que la de H 2 O 2 para los gram-negativos bacteria E. coli 25922, y más de 1000 veces superior al de H 2 O 2 por microorganismos gram positivos como S. aureus 29213.

Animal de seguridad y toxicidad

Estabilizado HOCl es reactiva, y por lo tanto, no es persistente. Para evaluar su potencial toxicidad, algunos bien establecidos modelos animales se utilizaron. Estabilizado HOCl se encontró en nonirritating (ojo de conejo) y en nonsensitizing (cuy) modelos animales (cuadro 5]. No irritación ocular se observó tras la instilación de una formulación de desarrollo (0,013% HOCl) en los ojos de pigmentada holandés conejos cada 8 horas durante 72 horas (datos no presentados). HOCl estabilizado a concentraciones del 0,01%, 0,03% y 0,10% w / v en una norma Buehler-diseño estudio de sensibilización dérmica en cobayos no mostró evidencia de reacción cutánea. Del mismo modo, 28 días en los estudios de toxicidad espesor total heridos ratas y mini-cerdos con aplicación diaria de HOCl estabilizado en 0,01%, 0,03%, y 0,1% w / v, junto con las 24 horas del día oclusión apósito no mostró evidencia de toxicidad sistémica . Examen microscópico de la zona de la herida mostraba la espera señales de heridas y la posterior reparación. Un resumen de todos los resultados toxicológicos de seguridad con estabilizado HOCl se muestra en la Tabla 5.

DISCUSIÓN

El germicida propiedades de HOCl han sido bien informado. 1, 10, 13, 20, 21, 24 Hipocloroso ácido se utiliza ampliamente como desinfectante, por ejemplo, en desinfección soluciones de lavado y piscinas. En estas aplicaciones, los reactivos químicos se forman en solución mediante la adición de cloro al agua. Del mismo modo, HOCl se utiliza para el tratamiento de agua potable y se formó tras la adición de cloro gaseoso o NaOCl.

La Figura 2 muestra la distribución relativa molar de diversas especies de cloro en un sistema de solución salina en función del pH. Entre los niveles de pH de 3 y 6, la especie predominante es HOCl. A mayor pH, iones hipoclorito (OCl -) está formado, mientras que a pH más bajos, la solución existe como una mezcla de cloro (Cl 2) en solución, gas de cloro en la cabeza, y HOCl. El control de esta reacción se ha utilizado en las prácticas industriales para optimizar la disponibilidad de los activos antimicrobianos, HOCl.

En el presente informe, se estabilizó HOCl es preparado por la adición de NaOCl a una solución de cloruro sódico en agua estéril, seguido por adición de una solución de ácido clorhídrico para formar el componente activo, HOCl. Estabilizado HOCl (denominado NVC-101) es una solución diluida de HOCl a 150 mm (0,9%) de cloruro de sodio unbuffered a un pH de 3,5. La solución se almacena en recipientes cerrados inerte diseñada para una máxima estabilidad del producto.

Como se muestra en la Figura 2, en un rango de pH de 3 a 6, la especie predominante es HOCl. En valores de pH superior a 5,5, iones hipoclorito (OCl -) está formado, y en torno a pH 7,5 (p Ka la HOCl de cloro de las especies en solución se encuentra en mezcla 50/50% [HOCl / OCl -]). 12 Como el aumenta el pH de 9,5, la concentración de OCl - en la solución alcanza su máximo nivel, convirtiéndose en el 100% de hipoclorito (conocida también como la lejía). Sin embargo, en la parte ácida a pH inferior a 4, la solución existe como una mezcla de cloro (Cl 2) en fase acuosa, gas de cloro en la cabeza, tricloruro (Cl 3 -), y HOCl. A pH inferior a 3, una cantidad apreciable de gas Cl 2 formas, lo que puede causar la rápida pérdida de cloro activo de todos en un recipiente abierto. Para mantener la solución estable y mantener su actividad deseada, el pH de la solución debe permanecer entre 3,5 y 5 y la solución debe almacenarse en un contenedor sellado herméticamente. Por primera vez, hemos sido capaces de determinar estas condiciones para estabilizar HOCl y para evaluar sus propiedades biológicas como un producto farmacéutico.

El efecto biológico de HOCl en bacterias ha sido ampliamente estudiado. 22, 25, 26 HOCl ha de amplio espectro de actividad antimicrobiana y es capaz de matar microorganismos con gran rapidez. Respiratorio pérdida de la membrana celular bacteriana como consecuencia de una reacción irreversible de HOCl con azufre y hemo-membrana que contiene enzimas y proteínas estructurales 12 conducir a la muerte celular y nonviability. 21, 22, 25

Antisépticos tópicos con una larga historia de uso, como NaOCl (Dakins' solución), peróxido de hidrógeno, ácido acético, y yodo-povidona permanecer en uso generalizado hoy en día. Estos agentes antimicrobianos utilizados en las concentraciones típicas son citotóxicos e impedir la cicatrización de heridas, por lo que son ahora desalentada por algunos expertos para su uso en úlceras crónicas. NVC-101 es una baja concentración, acidificadas, unbuffered solución de HOCl en solución salina. En las condiciones de la formulación, el ingrediente activo es el principal HOCl en equilibrio con una pequeña cantidad de cloro disuelto. Los estudios presentados han demostrado que HOCl exposiciones estabilizado rápido, dependiente de la concentración de actividad contra una amplia variedad de bacilos gram-negativas y gram-positivos bacterias, levaduras y hongos patógenos, siempre y cuando el estrecho rango de pH efectivo se mantiene. In vivo, HOCl se produce intracelularmente en abundancia en respuesta a la fagocitosis de los agentes patógenos de los neutrófilos y desempeña un papel importante en la destrucción de agentes patógenos.

HOCl, el ingrediente activo de estabilizado HOCl (NVC-101), tiene un rápido y amplio espectro de actividad antimicrobiana contra microorganismos clínicamente relevantes in vitro e in vivo. Aunque vegetativo bacterias son más susceptibles a NVC-101 que endospore-bacterias y hongos (Tabla 1], NVC-101 es plenamente capaz de inactivar todos los grupos de gram-negativas y gram-positivos bacterias, levaduras y hongos, entre ellos S. aureus meticilino-resistente S. aureus, resistente a la vancomicina E. faecium (Tabla 1], y Bacillis anthracis esporas (datos ahora se muestra). NVC-101 ha demostrado ser nonirritating y nonsensitizing en modelos animales. No hubo evidencia de irritación ocular tras una única instilación de NVC-101 en los ojos de Nueva Zelanda Blanco conejos en concentraciones de 0,01%, 0,03%, y 0,1% w / v. No irritación ocular se observó tras la instilación de un desarrollo en la formulación de los ojos de pigmentada holandés conejos cada 8 horas durante 72 horas (datos no presentados). NVC-101 en concentraciones de 0,01%, 0,03%, y 0,1% w / v en una norma Buehler-diseño estudio de sensibilización dérmica en cobayos no mostró evidencia de reacción cutánea.

El ingrediente activo es reactiva, y por lo tanto, no es persistente. Su persistencia de las propiedades antimicrobianas aún no ha sido probado en la herida en vivo el medio ambiente. Por lo tanto, la absorción y la toxicidad sistémica se espera que sea insignificante. Por lo tanto, en los 28 días de la herida estudios de toxicidad en ratas y mini-cerdos con aplicación diaria de NVC-101 a 0,01%, 0,03%, y 0,1% w / v, con 24 horas de oclusión vestirse, no existen pruebas de que sistémica toxicidad. Por otra parte, el examen microscópico de la zona de la herida mostraba la espera señales de heridas y la posterior reparación.

Heggers colegas y 26 han investigado los efectos tóxicos de varias concentraciones de NaOCl (a pH 7,5, esto fue en realidad una mezcla 50:50 de NaOCl y HOCl) in vitro e in vivo en ratas incisión modelo. Las concentraciones utilizadas en estudios anteriores son a menudo bastante alto y aunque tenían propiedades antimicrobianas, sino que también exhiben algunas toxicidad local que no era deseable. Heggers et al. llevaron a cabo sus experimentos en el rango de concentraciones que espera que sea activo, pero no tóxicos para las células o perjudicial para la cicatrización de heridas. Las concentraciones evaluadas fueron el 0,25%, 0,025% y 0.0125% w / v en los estudios in vitro y el 0,25% y 0,025% w / v en los estudios in vivo. Diez cepas clínicas se utilizaron en los estudios in vitro (tanto gram-positivas y gram-negativas especies). El potencial bactericida de los 3 se determinó la concentración. Todas las concentraciones muertos gram-positivas las bacterias dentro de los 30 minutos, pero la concentración más baja no matar bacterias gram-negativas. Fibroblastos de ratón fueron expuestos a diferentes concentraciones de NaOCl de 10 -, 20 -, o de 30 minutos. Estas células se mantuvo viable, salvo en los más altos de concentración, donde la muerte celular de 10 minutos se observó. En la incisión modelo de rata, 3 (2,5 cm) de espesor total heridas fueron creados por cada animal. Las incisiones se cerraron y la cubierta de gasa está saturado, cada 4 horas con el NaOCl o solución salina. Subconjuntos de animales fueron sacrificados en los días 3, 7 y 14. Muestras de tejido fueron recogidos. Resistencia a la rotura se midió (fuerza requerida para la ruptura de la cicatriz, en kilogramos). Los valores de la rotura fueron mayores en función de la duración, pero el tratamiento y control de grupos no fueron diferentes. Este estudio concluyó que la concentración de 0,025% conserva su propiedad bactericida sin causar daño a las células fibroblastos.

Dakins' solución (NaOCl) se ha utilizado como un antimicrobiano durante décadas. Un estudio para evaluar la actividad bactericida y la toxicidad del 0,5% y 0,1% NaOCl se llevó a cabo 27. Toxicidad Sólo la parte del estudio se discute aquí. El insulto a conejillo de piel se evaluó tras la aplicación del 0,5% de NaOCl solución tamponada a un pH de 7,49 hasta un máximo de 2 semanas (gasa empapada resoaked cada 8 horas). Los animales fueron sacrificados en el día 1, 4, 7, o 14. El cabello fue retirado de la piel antes de su aplicación, pero la piel está intacta. La aplicación de solución 0,5% tradujo en la toxicidad de células basales (15% de disminución de la viabilidad después de 2 semanas de tratamiento), por lo que una menor concentración de 0,1% fue evaluado solución (pH 7.4). Esta menor concentración no dio lugar a la toxicidad a las células basales. El Control y la piel tratada sitios fueron similares cuando la morfología microscópica se evaluó. Hiperplasia epidérmica y una respuesta inflamatoria afluencia se observó en los animales tratados a las 2 semanas. Los autores concluyeron que las soluciones son candidatos a la terapéutica lesiones térmicas. Es importante señalar que a pH 7,4, estas soluciones se tienen aproximadamente equimolar cantidades de HOCl y NaOCl.

En el presente estudios comparativos, hemos demostrado que el H 2 O 2 y el hipoclorito (NaOCl) son eficaces contra ciertas bacterias (más eficaz contra gram negativos, pero no gram positivos). Sin embargo, los antimicrobianos eficaces rangos de concentración comienzan a correlacionar con mayor citotoxicidad en células de mamífero, en comparación con NVC-101. Este antiséptico perfil de NaOCl se asemejan a algunos de los de venta libre antisépticos: plata, nitratos o iones de plata, Betadine, y ácido acético (datos no presentados). Por otra parte, hay otros antisépticos que son menos tóxicos para las células de mamífero, pero al mismo tiempo tienen menor actividad antimicrobiana (etanol, el peróxido de hidrógeno, y un 5% de solución de acetato de mafenide) en comparación con NVC-101 (datos no presentados). El Departamento de Salud y Servicios Humanos de la utilización de métodos comúnmente utilizados soluciones antisépticas para tratar la infección de la herida en general y nonhealing heridas crónicas, en particular, porque, por razones mencionadas anteriormente, sus usos están contraindicados. Por lo tanto, los datos presentados en este estudio debería ayudar en la selección de los agentes antimicrobianos más seguros para la desinfección de heridas, al riego ya vestirse. Esta reevaluación de las pruebas acumuladas se pretende sirva de base para ayudar a los profesionales tomar decisiones informadas para la elección de los antimicrobianos tópicos apropiados para el cuidado de heridas.

Como el desarrollo de resistencia bacteriana a los antibióticos continúa y la controversia en relación con el uso de antisépticos tópicos persiste, la necesidad de la investigación y el desarrollo de nuevas clases de agentes antimicrobianos que sean seguros y eficaces y en general tienen una baja toxicidad y la baja propensión a inducir resistencia a los antimicrobianos se convierte inevitablemente crítica. Actualmente, el uso de un amplio espectro de antibióticos tópicos para el tratamiento de heridas que no son para curar o en riesgo de infectarse, no se recomienda por el Departamento de Salud y Servicios Humanos de 28. Estas recomendaciones se basan en las siguientes razones: los antibióticos pueden causar reacciones alérgicas, especialmente cuando se aplica tópicamente pueden tener menor distribución de tejidos; mayor efecto sobre la microflora endógena (alteración de la microflora normal de comensales); inducir resistencia y, finalmente, han reducido la eficacia terapéutica. Por la misma razón, antisépticos, no se incita a causa de su mayor toxicidad, el potencial de desarrollo de resistencia (como los antibióticos) y, más importante, impacto directo en proceso de cicatrización de la herida.

La eficacia de los agentes antimicrobianos tópicos en el manejo de infecciones graves, por ejemplo, biofilm y relacionadas con el catéter heridas, sobre todo cuando crónica y nonhealing, no es concluyente. Estas observaciones varían mucho debido a (a) incompatible ensayo in vitro pliego de condiciones, (b) la utilización de diferentes modelos de especies animales, (c) el uso de diferentes organismos para determinar la eficacia resultado. Por lo tanto, los resultados generales realizar comparaciones directas inferior al ideal. Si bien los ensayos in vitro es necesario para seleccionar los posibles agentes de ensayos clínicos, estos modelos nunca totalmente imitar las condiciones in vivo.

Por lo tanto, a la luz de los resultados publicados en HOCl y los datos obtenidos en las actuales investigaciones, hay suficientes pruebas para demostrar que nuestra nueva formulación de HOCl (NVC-101), que se asemeja a la molécula de HOCl formuladas por los neutrófilos durante oxidativo ráfaga (natural proceso de defensa contra los microorganismos invasores), podría prestarse para seguros y eficaces modalidades de tratamiento de la infección. A causa de NVC-101 de amplio espectro, de acción rápida actividad antimicrobiana, las posibilidades de desarrollar resistencia sería mínima y sobre la base de su perfil de seguridad la posibilidad de daños colaterales a los tejidos infectados es también muy bajo. Por lo tanto, los experimentos in vivo en una infección crónica granulación herida modelo están previstas para determinar NVC-101 la capacidad de persistir en un ambiente hostil donde el pH puede no ser ideal y donde la inflamación puede producir exudados que limitan su uso como un agente de cuidado de heridas.

Autores extender su gratitud al Dr Sidney Kustu para su ediciones críticas y comentarios sobre este manuscrito y al Dr Sandra Morseth por su asistencia con el diseño y gestión de las buenas prácticas de laboratorio y la irritación de la piel de ratas / mini-cerdo estudios de toxicología.