Journal of Brachial Plexus and Peripheral Nerve Injury, 2007; 2: 11-11 (más artículos en esta revista)

La hiperglucemia altera la actividad enzimática y el número de células en los ganglios espinales sensoriales

BioMed Central
A Richard Zaruba (zaruba@medicine.nodak.edu) [1], Paul Epstein N (paul.epstein @ louisville.edu) [2], Patrick Carr A (pcarr@medicine.nodak.edu) [1]
[1] Departamento de Anatomía y Biología Celular, Facultad de Medicina y Ciencias de la Salud, Universidad de North Dakota, Grand Forks, ND 58202, EE.UU.
[2] Departamento de Pediatría, Universidad de Louisville, Louisville, KY 40202, EE.UU.

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Resumen

Sensorial periférica neuropatía diabética se caracteriza por morfológicas, electrofisiológicas y cambios neuroquímicos a una subpoblación de neuronas aferente primaria. En este sentido, utilizó un modelo de ratón transgénico de la diabetes (OVE26) y emparejados por edad para los controles histológicamente examinar el efecto de la hiperglucemia crónica en la abundancia o la actividad de las enzimas fosfatasa ácida, y citocromo oxidasa NADPH-diaphorase en la neurona sensorial primaria y la perikarya asta dorsal de la médula espinal. Cuantitativas densitométricas caracterización de la enzima producto de reacción reveló diferencias significativas entre los diabéticos, en comparación con el control, los animales para las tres enzimas. Los niveles de fosfatasa ácida reacción se encontraron productos que se redujo significativamente en ambos diámetro pequeño sensorial primaria y somata el asta dorsal. Citocromo oxidasa actividad resultó ser significativamente menor en los pequeños sensorial primaria, mientras que somata NADPH-diaphorase etiquetado resultó ser significativamente mayor en las pequeñas sensorial primaria somata y significativamente inferior en el asta dorsal. Además de estos cambios bioquímicos observados, ratiometric análisis del número de los pequeños frente a gran diámetro perikarya sensorial primaria en diabéticos y control de animales cuantificables demostrado una disminución del número de células de pequeño diámetro en los ganglios espinales de ratones diabéticos. Estos resultados sugieren que el modelo OVE26 de la diabetes mellitus produce una perturbación identificables en las vías metabólicas específicas de seleccionar a las células sensoriales del sistema nervioso y que esta disfunción puede reflejar la progresión de una pérdida de células demostrado.

Fondo

Neuropatías diabética sensoriales son un común, clínicamente observado secuelas de la hiperglucemia y se caracterizan por una degradación progresiva de la función aferente primaria [1, 2]. Funcionales y estructurales pruebas sugieren una pronta y frecuente participación de pequeño diámetro neuronas sensoriales primarias que conduzcan a nociceptivo anomalías [2 - 4]. Con el fin de examinar los mecanismos básicos que subyacen a esta enfermedad, utilizó los OVE26 ratón transgénico modelo de la diabetes mellitus [5, 6] para examinar los efectos de larga data en la hiperglucemia enzima histoquímicas indicadores de metabolismo de las neuronas sensoriales y evaluar la utilidad potencial de este modelo para estudios futuros de la neuropatía diabética. El OVE26 ratón utiliza la línea de células específicas de sobreexpresión de calmodulina para destruir β-pancreática células y el resultado es un ratón diabético viable (> 1 año de supervivencia) que muestra tanto de aparición temprana (<1 semana después de nacer) y crónica arterial elevada glucosa (> 500 mg / dl) y la disminución de suero y pancreática de insulina (<50% del normal) [5, 6]. Enzima técnicas histoquímicas demostrado ser sensibles a las perturbaciones neuronales [7] se utilizan para examinar el impacto de larga data y hypoinsulinemia la hiperglucemia sobre la distribución y la actividad de lisosomales ácido β-glycerophosphatase (AP), citocromo oxidasa (CO), y NADPH - diaphorase (NADPH-d, con una correlación de la sintetasa del óxido nítrico en los tejidos fijos aldehído [8]] en ambos sentidos y los ganglios de la médula espinal. Se ha demostrado con anterioridad [7, 11] que el estado metabólico de las neuronas sensoriales, como se refleja en la actividad endógena de enzimas específicas homeostático, es sensible a las lesiones y la perturbación. Por lo tanto, estas enzimas fueron seleccionados como supuestamente reflexivo de la función mitocondrial (CO), lisosomales degradative o actividad (AP) y la neurona sensorial primaria o la reparación del perjuicio (NADPH-diaphorase).

El OVE26 línea de ratones transgénicos (caracterizada por la insulina-promotor ligado sobreexpresión de calmodulina en el páncreas células β-) utilizado en este estudio muestra un bien caracterizado hiperglicemia crónica y hypoinsulinemia dentro de días después del nacimiento. [5, 6]. Diez (cinco OVE26 transgénicos y cinco emparejados por edad, los animales de control FvB) años de edad (> 365 días de edad) Los animales fueron anestesiados con pentobarbital, perfundidos con 4% paraformaldehído lumbar y la médula espinal y los ganglios sensoriales eliminado, seccionadas y procesadas para AP, CO o NADPH-d histoquímica de enzimas como anteriormente se ha descrito [7, 9 - 12]. Condes de somata sensoriales primarias se llevaron a cabo en azul de toluidina counterstained secciones de los ganglios espinales L5 y cuantificarán mediante metodologías publicadas con anterioridad [7, 12].

Análisis cuantitativo de CO, AP y NADPH-d tinción se llevó a cabo en el asta dorsal de la L5 segmento de la médula espinal y las grandes y pequeñas células de ganglio sensorial L5 utilizando anteriormente descrito densitométricas análisis [7, 12]. Toda la mediolateral medida de lámina Ia III fue seleccionado para la medición de la intensidad de la tinción. Los análisis estadísticos (t-test, Mann-Whitney Rank Sum prueba, una forma de análisis de varianza, Kruskal-Wallis análisis de la varianza en los grados, z-test de proporciones) se realizaron utilizando SigmaStat (Jandel). Controles para densitométricas análisis consistió en: 1) la sección simultánea y el montaje del diabético y el control sobre el tejido mismo de diapositivas para garantizar idénticas de procesamiento histológico, 2) análisis estadístico para verificar la coherencia de tinción entre los animales en control y grupos experimentales; 3) la corrección para las pequeñas fluctuaciones en los tejidos de opacidad / espesor de sustracción de iluminación mediante el cual el valor de densidad de la materia blanca se restará de la inmediatamente adyacente cuerno ventral, y 4) y ajuste manual de calibración de la cámara de vídeo parámetros microscopio y la iluminación y la adquisición de todas las imágenes usando la configuración idéntica. Todos los experimentos se llevaron a cabo de conformidad con las directrices de nuestras instituciones y los Institutos Nacionales de Salud en relación con el cuidado y uso de animales para experimentación procedimientos.

Antes de fijador de perfusión, la situación de fenotípica OVE26 ratones diabéticos fueron confirmados por su característica ojos pequeños causados por el GR19 de genes transgénicos en sus construir [5]. Todos los adultos OVE26 ratones alimentados mantenido niveles de glucosa en sangre de al menos 400 mg / dl. En el plano histológico, una encuesta [13] de la relación de los pequeños (50 y 500 μ m 2 de superficie) hasta grandes (500 y 1950 μ m 2 de área) somata sensorial primaria en la quinta lumbar los ganglios del puesto de manifiesto una disminución significativa en la proporción de pequeñas a grandes células en diabéticos (1.29:1 pequeño: grandes perikarya) en comparación con el control (1.94:1 pequeño: grandes perikarya), ratones (P <0,05 por test-z de proporciones; mide 417 células). Densitométricas análisis cuantitativo de la abundancia y distribución de la enzima histoquímicas producto de reacción en los ganglios de la raíz dorsal (DRG) ha puesto de manifiesto diferencias sustanciales entre la diabetes y el control de ratones (720 células fueron cuantificados para ambas densitometría y tamaño de celda; 240 células por cada enzima). Pequeños somata de los ganglios de los ratones diabéticos exhiben niveles más bajos de AP (13,4% de disminución, p <0,001) y CO (Fig. 1a, b; disminución del 9%, P <0,001) producto de reacción y un aumento en la densidad de la producto de reacción para NADPH-d (Fig. 1C, D; 13,2% de aumento; P <0,001) en comparación con los animales control. No se observaron diferencias en las neuronas de gran diámetro de diabéticos en comparación con los animales control.

En la médula espinal, todas las diferencias observadas se limita a la lámina Ia III. Motoneuron somata en el cuerno ventral parece tanto cualitativa como cuantitativamente similar en diabéticos y control de animales. En los animales diabéticos, se observa una pérdida de producto AP reacción en la lámina Iy II del asta dorsal (Fig. 2A], en comparación con ratones control (Figura 2B]. Del mismo modo, estas láminas parecía tener menos cualitativamente NADPH-d etiquetados fibras y neuronal somata en diabéticos (Fig. 2C] en comparación con los animales control. (Fig. 2D]. La disminución tanto de AP y NADPH-d etiquetado fue más profundo en la parte medial de la lámina Iy II. Análisis cuantitativos densitométricas apoya la observación cualitativa y reveló redujo significativamente los niveles de AP (P = 0,026; cuantificado 27 secciones) y NADPH-d (P <0,001; secciones 27 cuantificado) de productos de reacción en la lámina Iy II del asta dorsal de control y ratones diabéticos (Tabla 1]. No se observaron diferencias significativas en el aspecto cualitativo de tinción o la intensidad de la reacción de CO etiquetado de productos en el asta dorsal de la diabetes, en comparación con los no diabéticos animales (31 secciones cuantificados).

Aquí hemos demostrado que la hiperglucemia crónica tiene un impacto tanto sobre la supervivencia y el perfil metabólico de las neuronas sensoriales primarias. La disminución observada en la proporción de pequeños a grandes diámetros somata sensorial primaria en los animales diabéticos más probable es que representa una pérdida de unmyelinated o pequeñas mielinizadas neuronas sensoriales primarias a pesar de un aumento relativo del número de neuronas mielinizadas grandes, sin embargo, poco probable, no se puede descartar. Sin embargo, la primera interpretación es apoyada por la disminución observada en la PA en el etiquetado el asta dorsal de la médula espinal. La disminución observada en AP intensidad en la que sobreviven los pequeños neuronal somata de la DRG OVE26 de los animales, en comparación a las pequeñas neuronas de control DRG, sugiere que la actividad de fosfatasa ácida en las células está deprimido. Como FRAP que contienen las neuronas sensoriales representan una subpoblación de unmyelinated C-fibras [14], nuestros resultados sugieren que hay una pérdida, o al menos un trastorno metabólico de, unmyelinated neuronas en el asta dorsal y en DRG. Estos resultados son consistentes con la posibilidad de la apoptosis y la pérdida de células en el GRD de modelos roedores de la diabetes [15, 16], aunque las diferencias de modelo, las especies y la duración de la hiperglucemia debe ser considerado [17, 18], junto con la probabilidad de que hay un espectro de diferentes neuropatías diabéticas incluyendo dolorosa (pequeña participación de fibra) y no dolorosa (gran participación de fibra) síndromes [2, 3]. En vista de ello, no debería ser totalmente inesperado que nuestras observaciones putativo de un pequeño trastorno de fibra complementa los resultados de las grandes trastornos en fibra suplente modelos animales de diabetes [19].

Citocromo oxidasa es la enzima terminal en la cadena de transporte de electrones, y por lo tanto es considerado un fuerte indicador de la actividad mitocondrial somáticas. La disminución de CO en pequeñas manchas DRG neuronas, en comparación con la misma cohorte de pequeñas neuronas de los ganglios de control animal, sugiere un trastorno de metabolismo oxidativo, lo que corresponde bien con los resultados de otros modelos animales de diabetes que demuestran la disminución de CO actividad o trastorno en mitocondrial morfología o función [16, 20 - 22]. Por otra parte, nuestra observó disminución en la tinción de CO puede reflejar una simple disminución en el número mitocondrial, como DRG neuronas expuestas a altos de glucosa en la exposición in vitro contienen un menor número de mitocondrias [23]. La falta de un cambio observado en CO actividad en el asta dorsal no es inesperada como físico (axotomy) y funcionales (tetrodotoxin) desconexión se han mostrado a abandonar la actividad de CO en el asta dorsal sin perfeccionar [7].

En DRG y el asta dorsal de la médula espinal, NADPH-d niveles de actividad han sido previamente demostrado ser sensible a las lesiones neuronales periféricas o atenuación de la actividad eléctrica [7]. Nuestros resultados sugieren que, además de el estado patológico que condujo a nuestra observó pérdida de neuronas sensoriales (y la disminución de NADPH-d etiquetado en el cuerno dorsal), hay una perturbación en curso que resulta en una mayor NADPH-d etiquetado en las pequeñas neuronas de GRD hiperglucémicas animales en comparación con la primaria sensorial somata de normoglycemic animales. Como utilizado aquí, NADPH-d enzima histoquímicas reacción producto representa el óxido nítrico sintasa actividad [8]. La elevada ganglionic NADPH-diaphorase y la disminución de CO en el etiquetado de DRG hiperglucémicas ratones es coherente con anterioridad propuesto la inhibición de la actividad de CO [24] por el producto de la sintetasa del óxido nítrico, óxido nítrico. Aunque los informes sobre cambios estadísticamente significativos puede parecer cuantitativamente modesta, estos cambios representan por ciento promedio del grupo. Cualitativa y cuantitativamente, los cambios son más pronunciados en algunos tejidos animales y secciones, y menos evidente en otros. Esto no es inesperado enfermedades crónicas como los procesos de las personas con impacto profundo tanto en la variabilidad de gravedad y el progreso temporal.

Nuestros resultados sugieren que el modelo de OVE26 hiperglicemia crónica no alterar el perfil global neuroquímicos del sistema nervioso sensorial a través de la pérdida de células y / o alterado la actividad enzimática y que esta patología parece específicamente unmyelinated impacto y / o pequeñas mielinizadas neuronas sensoriales primarias.

Declaración de intereses

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

Autores de las contribuciones

RZ terminado este trabajo como parte de su tesis doctoral y ha participado en la redacción de este manuscrito y ha contribuido tanto intelectualmente y prácticamente con el contenido. PE creado, que se caracteriza y se suministran los ratones transgénicos y también participó en la redacción de este manuscrito y ha contribuido tanto intelectualmente y prácticamente con el contenido. PC siempre que el laboratorio, supervisión y apoyo a este trabajo, con exclusión de la asociada a la generación y caracterización de la modelo murino. PC también participó en el diseño y la coordinación de este estudio y participó en la redacción de este manuscrito y ha contribuido tanto intelectualmente y prácticamente con el contenido. Todos los autores leído y aprobado el manuscrito final.

Agradecimientos

Esta labor fue apoyada por ND EPSCoR y UNDSOMH.