Malaria Journal, 2007; 6: 45-45 (más artículos en esta revista)

Sub-localización celular y post-translacional de las modificaciones Plasmodium yoelii enolasa sugieren clandestino funciones

BioMed Central
Ipsita Pal-Bhowmick (ipsita@tifr.res.in) [1], Hardeep K Vora (hardeep.vora @ gmail.com) [1], Gotam K Jarori (gkjarori@yahoo.com) [1]
[1] Departamento de Ciencias Biológicas, Instituto Tata de Investigación Fundamental, Homi Bhabha Road, Colaba, Bombay - 400 005, India

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Resumen
Fondo

Enolasa (2-fosfato-D-glycerate hidrolasa; EC 4.2.1.11) es una de las enzimas glicolítico, cuyos niveles son muy elevados en parásito infectado glóbulos rojos. En varios organismos, enolases Se ha demostrado que no tienen diversas glicolítico (clandestino) las funciones biológicas. Como diversidad funcional de una proteína se requieren diversas sub-localización celular, la posibilidad de participación de Plasmodium enolasa clandestino en funciones fue examinado por la investigación de su sub-distribución celular murino en el parásito del paludismo, Plasmodium yoelii.

Métodos

Extractos celulares de P. yoelii se fraccionado en soluble (citosólicas) y partículas (membranas, citoesqueleto y nuclear) y las fracciones fueron analizadas por una y dos dimensiones electroforesis en gel. Estos se probaron a través de Western Blot utilizando anticuerpos recombinantes planteadas contra Plasmodium falciparum enolasa. Ensayo de inmunofluorescencia se utiliza para la localización in situ. Fe +3 metal basado en la cromatografía de afinidad se utilizó para aislar el fosfato proteoma fracción de p. yoelii extractos.

Resultados

Además de la esperada presencia de enolasa en el citosol, esta enzima también se encontró que se asocia con membranas, núcleos y citoesqueleto fracciones. Nuclear presencia también fue confirmado por inmunofluorescencia in situ. Cinco diferentes puestos translationally modificados isoformas de enolasa podría ser identificados, de los cuales al menos tres se debieron a la fosforilación de la forma nativa. Situ en la fosforilación de enolasa también se pone de manifiesto la presencia de enolasa en purificado fósforo-proteoma de p. yoelli. Cada sub-fracciones celulares mostraron diferentes perfiles de isoforma.

Conclusión

Asociación de enolasa, con núcleos, membranas celulares y citoesqueleto elementos sugiere no glicolítico funciones de esta enzima en P. yoelii. Sub-fracción celular específica isoforma perfiles indican la importancia de post-translacional diversas modificaciones en la localización de enolasa en P. yoelii. Además, se sugiere que después de la traducción de enolasa modificaciones pueden regir la contratación de enolasa para no glicolítico funciones.

Fondo

Enolasa (EC 4.2.1.11) cataliza la conversión entre los de 2-phosphoglycerate y phosphoenol piruvato durante glycolysis y la gluconeogénesis. Durante muchos años enolasa fue considerada como una enzima soluble glicolítico, exclusivamente presentes en citosol. Sin embargo, varios estudios recientes han demostrado que la enolasa es una proteína con múltiples facetas diversas funciones biológicas y sub-localizaciones celulares [1, 2]. Actúa como un receptor del plasminógeno en la superficie celular de ciertos agentes patógenos [3, 4] y ha sido implicado en funciones nucleares en protozoos [5, 6], las plantas [7] y las células animales [8, 9]. Enolasa también participa en la respuesta de estrés [10, 11] vacuolar los procesos de fusión [12] y molecular chaperoning funciones [13, 14].

Plasmodium falciparum es el agente causal de la forma más mortal de malaria. La sangre asexual etapas de este parásito, que son responsables de los síntomas clínicos de la enfermedad, carecen de tricarboxylicacid ciclo funcional y únicamente dependen de glycolysis de sus necesidades energéticas. Las células infectadas han ~ 50-100 veces mayor flujo glicolítico en comparación con los no infectados glóbulos rojos (eritrocitos) [15, 16]. Los niveles de algunos de los glicolítico que las enzimas son muy elevados y enolasa es uno de esos enzima cuya actividad son los niveles ~ 15-20 veces más altos que en las células infectadas [17]. Como se sabe enolases a participar en una serie de funciones de pluriempleo, es probable que pueda ser contratados para determinados otras funciones biológicas en el parásito. Como la participación de una proteína en múltiples funciones, invariablemente requieren el reclutamiento de sus diferentes sub-compartimentos celulares, el examen de la sub-localización celular de enolasa el parásito en las células puede aportar pistas a cualquier no-glicolítico funciones que pueda tener. Desde Plasmodium yoelii células pueden obtenerse fácilmente en grandes cantidades y muchos de la casa de mantenimiento de las proteínas son altamente homóloga con p. falciparum, este parásito de la malaria murino ha servido como un buen modelo para el sistema parásito del paludismo humano. Como enolases de estos dos organismos son ~ 90% homóloga, planteó anticuerpos recombinantes contra la p. enolasa falciparum podrían utilizarse para investigar sub-localización celular de enolasa en P. yoelli.

Materiales y métodos
Materiales

Recombinante p. falciparum enolasa (r-Pfen) fue purificado y anticuerpos policlonales se suscitaron en ratones, tal como se describe anteriormente [18]. Rabbit anti-p. falciparum aldolasa anticuerpo fue una especie de regalo de Profesor Victor Nussenzweig, del Departamento de Patología, NY University Medical Centre, Nueva York, EE.UU.. Todos los productos químicos utilizados fueron de grado Analar.

Métodos
Resultados
Enolasa está presente en soluble y partículas fracciones de P. yoelii

El parásito saponina haber precipitado sobre 10 6 células fue sometido a lisis de congelar y descongelar seguido por ultrasonidos y se centrifuga a 14000 × g durante 30 minutos para obtener soluble (sobrenadante) y partículas (pellet) fracciones. Las proteínas fueron separadas por SDS / PAGE (12% en gel) y Western Blot se realizó tal como se describe anteriormente [18]. Los resultados se presentan en la Figura 1A. Enolasa (~ 50 kDa banda) se encontró a estar presente en ambos (soluble y partículas) fracciones. Como era de esperar, la mayor parte de la enolasa estuvo presente en el citosol (~ 85-90%) siempre que sea necesario para glicolítico función. Sin embargo, ~ 10-15% enolasa se asoció con una fracción de partículas. Como la mayor parte de la enolasa se encuentra en citosol, existe la posibilidad de contaminar la fracción de partículas con células ininterrumpida. Para eliminar esta posibilidad, la mancha fue examinado también por la presencia de otro enzima glicolítico, aldolasa (utilizando anti-malaria por P. falciparum aldolasa anticuerpos). Como se muestra en la Figura 1A, aldolasa (~ 40 kDa banda) estaba presente sólo en la fracción soluble y estaba completamente ausente de la fracción de partículas, lo que sugiere que el precipitado fracción no tenía ninguna contaminación de la fracción citosólica. Del mismo modo, un extracto preparado a partir de la depurada merozoites (extra eritrocitarios etapa), también mostró la presencia de enolasa en soluble, así como la fracción de partículas (Figura 1B].

Dado que la fracción de partículas consistió en una variedad de sub-componentes celulares (membranas celulares, núcleos y elementos citoesqueleto), detergente fraccionamiento diferencial (DDF) se ha utilizado el método para solubilize selectivamente proteínas de diversos orgánulos [19]. 100 μ g de acetona en polvo derivados de solubilzed membranas, citoesqueleto y núcleos de los elementos fue analizado por SDS / PAGE. Los resultados presentados en la figura 1C, mostró enolasa de asociación con todos los tres sub-fracciones celulares.

Ensayo de inmunofluorescencia (IFA) mostró nuclear presencia de enolasa en P. yoelii

Un frotis de ratón infectado glóbulos rojos se tiñen con DAPI para localizar los núcleos del parásito y las células con anticuerpos anti-recombinante p. falciparum enolasa (anti-r-Pfen) anticuerpos para la localización de enolasa (Figura 2]. Una superposición de las dos imágenes muestran claramente la presencia de enolasa en el núcleo (que se muestra con flechas). En este Papanicolau, se observó que la presencia de enolasa es más prominente en la primera intra-eritrocítica etapas (anillo y trophozoite) en comparación con fines de multi-etapas schizont nuclear. La alta especificidad de la anti-r-Pfen anticuerpos para enolasa parásito se desprende del hecho de que ninguno de los eritrocitos no infectada son teñidas con anti-r-Pfen anticuerpos en este Papanicolau.

Diferentes isoformas de enolasa se asocian con diversas sub-fracciones celulares

Usando el detergente solubilización diferencial (DDF) método de la acetona en polvo se preparan a partir de citosol, membrana nuclear, citoesqueleto y fracciones (proteína completa complemento). Estas fracciones fueron analizadas por 2-dimensional gel de electroforesis (2-DIGE) y probaron con anti-r-Pfen anticuerpos para determinar si hay múltiples isoformas de enolasa en P. yoelii. Acerca de 0.8-0.9 mg de polvo de acetona se utilizó para cada análisis. Western blots de 2-DIGE de cuatro sub-fracciones celulares se presentan en la Figura 3A. Al menos cinco diferentes isoformas de enolasa con pI ~ 5,9, 6,1, 6,3, 6,5 y 6,7 se observan. Cada sub-fracciones celulares mostraron diferencias en el tipo de isoformas presentes y sus abundancias relativas. La fracción citosólica tenía cuatro puntos diferentes (~ pI 5,9, 6,1, 6,3 y 6,5) con la isoforma de pI ~ 6,3 siendo los más abundantes y la forma con pI ~ 5,9 siendo el menos. En esta fracción, un punto extra a pI ~ 6.5 (y posiblemente también en 6.3) se observó que tiene una mayor movilidad electroforética. Membrana fracción mostró dos formas con pI ~ 6,3 y 6,5, mientras que la fracción nuclear había una sola isoforma con un pI ~ 6,7. El citoesqueleto fracción tenía cuatro isoformas (~ pI 6,1, 6,3, 6,5 y 6,7), presente en casi igualdad de abundancia.

Con el fin de examinar si alguna de estas isoformas han surgido debido a la fosforilación de nativos enolasa, fracción citosólica fue tratado con fosfatasa alcalina y analizados. Esta muestra dio un solo punto en pI ~ 6,5, lo que sugiere que, efectivamente, las isoformas con pI ~ 5,9, 6,1 y 6,3 surgió debido a la fosforilación de enolasa nativos. Otra prueba in vivo para la fosforilación de enolasa se obtuvo tirando a cabo la phosphoproteome fracción de p. yoelli celular extracto a través de Fe 3-inmovilizada cromatografía de iones metálicos (IMAC) [20]. Si la enolasa fue fosforilados dentro de la célula, IMAC eluye fracción contendrá enolasa. Figura 3B muestra un gel de plata manchadas de p. yoelii extracto de células enteras (carril 1) y EDTA eluye phopho-proteoma de Fe-3 bolas (carril 2). Una mancha de este gel se probaron con anticuerpos anti-r-Pfen anticuerpos (Figura 3C]. Los resultados mostraron alto enriquecimiento de enolasa en la columna de metal afinidad eluye muestra, lo que apoya la opinión de que una fracción importante de la enolasa es, en efecto, fosforilados dentro de la célula.

Discusión

En este estudio, dos diferentes enfoques experimentales estaban empleados, a saber: (i) sub-bioquímica celular fraccionamiento seguido de Western blot y (ii) la ubicación in situ de inmunofluorescencia para investigar el celular sub-distribución de enolasa en P. yoelii. Un interesante resultado inicial de este estudio es la observación de la presencia de enolasa en la fracción de partículas (Figura 1]. Desde glycolysis ocurre en citosol y dentro de eritrocitarios de las etapas de Plasmodium se sabe que tienen alto flujo glicolítico [15, 16], se esperaba que los principales fracción de enolasa estará presente en el citosol. Los resultados presentados en la Figura 1A ~ sugieren que 85-90% de enolasa es citosólica y ~ 10-15% se asocia con la fracción de partículas. En los casos en que es una proteína muy abundante en una determinada sub-compartimento celular (citosol aquí), uno tiene que demostrar que la fracción de partículas no está contaminada con citosol y / o células ininterrumpida. Las siguientes pruebas apoya la opinión de que en el caso de P. yoelii, enolasa es, en efecto, asociados a diversos componentes de la fracción de partículas:

(i) La presencia de la aldolasa (otra enzima glicolítico) soluble en fracciones de partículas y se examinó. Los resultados presentados en la Figura 1A puso de manifiesto que la aldolasa estuvo presente en el citosol y totalmente ausente (o indetectable) en fracción de partículas, lo que indica que la fracción de partículas no está contaminada con citosol de las células o ininterrumpida;

(ii) a diferencia de detergente solubilización de la membrana celular, citoesqueleto y núcleos de elementos, enolasa estuvo presente en las tres fracciones (Figura 1B]. Es muy poco probable que enolasa soluble seguirá siendo asociada a esta multi-paso detergente solubilización de protocolo;

(iii) los perfiles de los diferentes isoformas enolasa (en términos de PI y su abundancia relativa) se asocia con cada una de las sub-celulares (citosólicas, membrana nuclear y citoesqueleto) fracciones es bastante singular (Figura 3A]. Si la presencia de enolasa en estas fracciones se debió a la contaminación citosólicas, cabría esperar para observar perfil similar para todas las fracciones, (iv) nuclear presencia de enolasa también es evidente de ensayo inmuno fluorescencia (Figura 2]. Todas las pruebas mostraron que aquí se presenta diversa localización de enolasa en el que pueden tener diferentes fisiológicas (pluriempleo) funciones. Ensayo de inmunofluorescencia para realizarse in situ la localización nuclear de enolasa demostró la presencia de cantidades variables de enolasa en las diferentes fases del parásito. Por ejemplo, el anillo etapa parásito tiene mucho más enolasa nuclear en comparación con fines de multi-etapa schizont nuclear (Figura 2]. Similares observaciones se han comunicado para T. gondii [5] y E. tenella [6]. Estas observaciones de la presencia nuclear de enolasa, se ha llegado a la sugerencia de que pueda desempeñar un papel en la regulación de expresión génica. En este contexto, el reciente informe acerca de la interacción directa con enolasa H3-histonas, proteínas nucleosoma montaje y la interacción indirecta a muchas otras proteínas nucleares (incluidas las histonas acetylase como enzimas) en P. falciparum asume importancia [21].

P. yoelii tiene un solo gen para la enolasa. Observación de cinco diferentes isoformas (~ pI 5,9, 6,1, 6,3, 6,5 y 6,7) sugiere que cuatro de estas variantes surgió debido a post-translacional modificaciones. Los resultados aquí presentados muestran que las formas con pI ~ 5,9, 6,1 y 6,3 surgió debido a múltiples phosphorylations. Es interesante observar que ninguna de estas formas fosforilados pasar al núcleo. Fosforilación de enolasa ha informado ampliamente en las bacterias [22], las plantas [23, 24] y los animales [25, 26]. Sin embargo, la importancia fisiológica de estas modificaciones no se entiende. Enolases son proteínas altamente conservadas a través de la especie y no posee ninguna señal de secuencias específicas de sub-localización celular. La observación (Figura 3] de sub-celulares fracción específica isoforma perfil sugiere que después de la traducción modificaciones podrán regular sub-localización celular de enolasa. La señal de localización nuclear (NLS) en una proteína normalmente es un tramo de aminoácidos básicos [27] y tal secuencia no está presente en la enolasa. Es interesante observar que la forma que se translocan al núcleo Plasmodium tiene el más básico Pi (pI ~ 6,7) entre todas las isoformas.

Conclusión

En resumen, en este trabajo se demostró que en P. yoelii, una pequeña fracción de enolasa se asocia con las membranas celulares, citoesqueleto y nucleares fracciones donde es probable que tenga diversas funciones clandestino. Además, se somete a la enolasa postraduccional varias modificaciones, tres de los cuales se deben a la proteína phosphorylations. El ácido formularios generados debido a phosphorylations in situ, están excluidos de localización nuclear. Cantidades variables de enolasa detectado en el núcleo en diferentes etapas del ciclo de vida del parásito, sugiere nuclear funciones para enolasa. Implícita en la localización de diversos enolasa, es la complejidad en sus funciones biológicas, lo que haría esta proteína un interesante objetivo de drogas para combatir el paludismo.

Autores de las contribuciones

IPB preparado la enolasa, planteó anticuerpos policlonales y llevó a cabo fractionations bioquímicos y estudios de inmuno fluorescencia. HKV realizado IMAC para phosphoproteome purificación. GKJ participó en el diseño y coordinación del estudio, con la asistencia en la redacción del manuscrito. Todos los autores han leído el manuscrito y aprobó la versión final presentada.

Agradecimientos

Nos gustaría dar las gracias al profesor Victor Nussenzweig, del Departamento de Patología, NY University Medical Centre, Nueva York, EE.UU., por el don de la especie de conejo anti-p. falciparum aldolasa anticuerpo, el doctor G. Swarup y la Sra Nandini Ranganathan del Centro de Biología Celular y Molecular, Hyderabad, India son reconocidos por haber permitido y nos ayuda a utilizar su microscopio confocal de instalación.