Mediators of Inflammation, 2007; 2007: (más artículos en esta revista)

La tensión de descanso afecta a ENOS la actividad en un calcio-dependientes en Camino Airways

Hindawi Publishing Corporation
Eudoxia Kitsiopoulou [1], Apostolia A. Hatziefthimiou [1], Konstantinos I. Gourgoulianis [2], Paschalis-Adam Molyvdas [1]

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Resumen

La alteración de la tensión de descanso (RT) de 0,5 g a 2,5 g aumentado considerablemente músculo liso bronquial contracciones inducidas por la acetilcolina (ACh) en conejo tráquea. La disminución en la concentración de calcio extracelular [Ca 2 +] o de 2 mm a 0,2 mm de reducción de ACh contracciones inducidas a sólo 2,5 g RT sin efecto a 0,5 g RT. El nonselective inhibidor de la óxido nítrico sintasa (NOS), N G-nitro-L-arginina metil éster (L-NAME) un aumento de ACh contracciones inducidas a 2,5 g RT. El inhibidor de la NOS inducible, S-methylsothiourea o neuronal NOS, 7-nitroindazole no tuvo ningún efecto. En 2,5 g RT, la reducción de [Ca 2 +] o de 2 mm a 0,2 mm abolido el efecto de L-NAME-ACh en las contracciones inducidas. El NO precursor L-arginina o los inhibidores de tirosina quinasa A erbstatin Genistein y no tuvo ningún efecto sobre ACh contracciones inducidas obtenidos en el 2,5 g RT. Nuestros resultados sugieren que en las vías respiratorias, afecta RT-ACh contracciones inducidas por la modulación de la actividad de NOS epiteliales en un dependiente de calcio, la fosforilación de la tirosina-independiente.

1. INTRODUCCIÓN

El óxido nítrico (NO) se libera de una gran variedad de tipos de células incluyendo las células epiteliales, los nervios, y células inflamatorias en las vías respiratorias [1]. NO es el producto final de la conversión de L-arginina a L-citrulina y esta reacción es catalizada por la NO sintasa (NOS). Funcionalmente, NOS isoformas se distinguen en un constitutiva (cNOS) y una forma inducible (iNOS) forma [2]. El constituyente isoformas de NOS, neuronal (nNOS) y endotelial (ENOS) parecen proteger las vías respiratorias excesivo de la broncoconstricción, mientras que iNOS tiene un papel modulador en trastornos inflamatorios de las vías respiratorias como el asma [3].

NOS Constitutiva se activa por un aumento en la concentración de calcio intracelular que a su vez promueve la unión a calmodulina NOS y cantidades bajas emisiones de NO por períodos cortos de tiempo en respuesta a los receptores y la estimulación física [4]. Los estudios realizados en buques proporcionar convincente evidencia experimental de que Enos puede ser estimulada por dos vías de señalización independientes y es diferencialmente activados por los receptores dependientes de los agonistas y los estímulos mecánicos. En particular, la activación de los receptores de Enos que dependen de agonistas como la acetilcolina, histamina, bradicinina o está mediado por un aumento de calcio intracelular [4], mientras que su activación por estímulos mecánicos, como el estrés de cizalla es inducido por su fosforilación [5 - 7].

En conejo tráquea, las vías respiratorias epitelio modula la respuesta del músculo liso bronquial (ASM) a la acetilcolina en función de la tensión inicial [8, 9]. Este efecto ha demostrado ser mediado, al menos en parte, a través de liberación de NO [9]. Por lo tanto, el propósito de este estudio fue investigar el efecto ejercido por la tensión de descanso (RT) de las vías respiratorias del músculo liso en la activación de ENOS y el mecanismo (s) involucrados.

2. MÉTODOS

Contractilidad se han realizado estudios con tiras traqueal obtenidos de los adultos de sexo masculino o femenino conejos (aproximadamente 2 Kg de peso corporal). Conejos se mantuvieron en jaulas individuales bajo un ambiente controlado que consta de 12 horas de luz-oscuridad ciclo y temperatura ambiente de 22 ° C, se les proporcionó alimentos y agua antes de su utilización para el estudio, y fueron tratados de conformidad con ética y directrices institucionales . Los animales fueron sacrificados por una sobredosis de administración intravenosa de pentobarbital de sodio (Vétoquinol, Francia). Exothoracic tejido traqueal fue removido y colocado en solución de Krebs (pH 7,4 a 37 ° C) con la siguiente composición (en mm): Na + 137; Mg 2 + 1,1; K + 5,9; Cl -- 123,0, Ca 2 + 2, H 2 PO 4 -- 1,2; HCO 3 -- 24,9, 9,6 y glucosa. La solución fue gaseado con un 95% O 2 y el 5% CO 2 . En experimentos llevados a cabo en solución de Krebs con baja concentración de calcio, la solución tenía la misma composición, salvo que la concentración de calcio fue de 0,2 mM. La concentración de calcio extracelular 0,2 mm se ha elegido porque es inferior al umbral sugerido de calcio para epiteliales modulador ACh en parte inducida por la contracción [10] y no afectó a ASM pasiva tensión.

La tráquea es limpiar de tejido conectivo que rodea y tiras traqueal (2 mm de ancho, 14 mm de longitud) se obtuvieron a partir de anillos traqueales disecados a partir de mediados tráquea con la asistencia de SZ30 Olympus stereoscope. El espesor de la capa de músculo liso se midió con la ayuda de un microscopio invertido (Nikon DIAPHOT 300), una cámara de video color (TK-1281, JVC) y monitor (TM-290ZE, JVC), así como mediante una zapata ( 0.0025 resolución mm 2). A continuación, los anillos cartilaginosos se redujeron frente a la capa de músculo liso. Cada tira se colocó con el superfused luminal hacia arriba en una camisa de agua de baño de órganos. Un extremo del cartílago se utilizó para la preparación pin a los Sylgard 184 (Dow Corning) de la parte inferior horizontal órgano baño, mientras que el otro extremo se utilizó para montar la tira a la fuerza-transductor de desplazamiento. Traqueal tiras se estira manualmente a 0,5 g ó 2,5 g RT y se permitió que durante al menos 60 minutos. Experimentos preliminares han demostrado que en el 2,5 g RT, los países desarrollados con la tensión de la MPE a ACh se encuentra dentro de la parte lineal de la RT-curva de tensión.

Toda la banda está en constante perfundido con solución de Krebs oxigenada a 37 ° C. Acetilcolina M 10 -9 a 10 -3 M se añadió acumulativa al órgano baño. Los cambios en la tensión se registraron en una fuerza FT03C Grass-transductor de desplazamiento y se muestra a través de un Grass 7400 fisiológicas grabador.

En experimentos en los cuales N G - nitro-L-arginina metil éster (L-NAME, 10 -4 M), S-methylisothiourea (SMT, 10 -4 M), 7-Nitroindazole (7-NI, 10 -4 M), L-arginina (10 -3 M), erbstatin A (3 × 10 -6 M), y el Genistein (3 × 10 -6 M) fueron utilizados, las tiras fueron incubadas con cada uno de estos agentes durante 30 minutos antes de la acetilcolina se añadió.

La máxima tensión generada activa en respuesta a diferentes concentraciones de acetilcolina se calculó; valores se expresan en vigor en gramos por cada sección transversal en milímetros (mm -2 g). Todos los datos se ofrecen como medios ± error estándar (SE) y N se refiere al número de animales. Los datos fueron comparados por un solo sentido el análisis de varianza (ANOVA) con diferencias estadísticamente significativas entre los grupos están determinadas por Bonferroni's post-hoc de prueba, mientras que las diferencias estadísticas entre ambos grupos fueron realizadas por Mann-Whitney muestras independientes de prueba. La comparación se considera significativa cuando P <.05. El análisis estadístico se realizó mediante SPSS V11. El ajuste de curvas y dibujo gráfico se llevaron a cabo utilizando el gráfico de paquetes, Sigma Plot 2001.

Acetilcolina, L-NAME, SMT, 7-NI, L-arginina y el Genistein se obtuvieron de Sigma (Alemania). A Erbstatin se obtuvo de Calbiochem (Calif, EE.UU.).

3. RESULTADOS

La alteración del IM de 0,5 g a 2,5 g aumentado de manera significativa las contracciones inducidas por M 10 -6 a 10 -3 M ACh (P <.05) (Figura 1]. Este efecto del impuesto de matriculación en la capacidad de respuesta de ASM a ACh depende de la concentración de calcio extracelular. De este modo, a baja concentración de calcio no hubo diferencias en la ACh contracciones inducidas obtenidos a 0,5 g y 2,5 g RT (Figura 1]. Las fuerzas isométrica desarrollado por 10 -3 M ACh fueron 24,18 ± 6,34 g -2 mm y 72,41 ± 4,15 mm -2 g a 0,5 g y 2,5 g RT, respectivamente (P <.001, Figura 1]. A bajas extracelular Ca 2 + concentración, las fuerzas isométrica desarrollado por 10 -3 M ACh fueron 37,97 ± 4,07 g -2 mm y 48,26 ± 8,95 mm -2 g a 0,5 g y 2,5 g RT, respectivamente (Figura 1]. En 2,5 g RT, la disminución en la concentración de calcio extracelular reducido las contracciones inducidas por 10 -6, 10 -4 y 10 -3 M ACh (P <.05), (Figura 1], sin efecto sobre ACh contracciones inducidas obtenidos a 0,5 g RT.

En 0,5 g RT, la presencia de L-NAME, un inhibidor de NOS nonselective, no tuvo ningún efecto sobre ACh contracciones inducidas (Figura 2 (a)]. Por el contrario, a 2,5 g RT, la presencia de L-NAME en el medio perfusing aumentado de manera significativa las contracciones inducidas por M 10 -6 a 10 -3 M ACh (P <.05, Figura 2 (b)]. En 2,5 g RT, L-NAME aumento de las contracciones obtenidos por 10 -3 M ACh a 101,08 g ± 5,95 mm -2. El pretratamiento de los preparativos con inhibidor de la iNOS, SMT o inhibidor de nNOS, 7-NI, no tuvo ningún efecto sobre la capacidad de respuesta de ASM a ACh (Figura 2 (b)].

La disminución en la concentración de calcio extracelular suprime el efecto de L-NAME-ACh en las contracciones inducidas obtenidos en el 2,5 g RT. De este modo, a baja concentración de calcio extracelular, L-NAME no tuvo ningún efecto sobre ACh contracciones inducidas por obtenerse en cualquiera de 0,5 g ó 2,5 g RT (Figura 3].

El pretratamiento de los preparativos con el precursor de NO, L-arginina, no tuvo ningún efecto sobre ACh inducida por las contracciones en RT, ya sea de 0,5 g (Figura 4 (a)] o 2,5 g (Figura 4 (b)]. Del mismo modo, a 2,5 g RT, la presencia de la proteína tirosina quinasa erbstatin un inhibidor o Genistein perfusing en el medio no tuvo ningún efecto sobre ACh contracciones inducidas (Figura 5].

Las alteraciones de las concentraciones de calcio extracelular, así como la presencia de L-NAME o SMT o 7-NI o L-arginina en el medio perfusing no tuvo ningún efecto sobre la tensión pasiva (datos no presentados).

4. DISCUSIÓN

La alteración del IM de 0,5 g a 2,5 g aumentado de manera significativa la capacidad de respuesta de ASM para la acetilcolina. Hay pruebas de que en el músculo liso, las fuerzas mecánicas podrán regular el calcio intracelular por múltiples vías [11 - 16]. Los mecanismos propuestos son el flujo de iones, incluyendo calcio, se extienden a través de canales activados, la despolarización de membrana, y la consiguiente afluencia de calcio a través de voltaje-activados los canales de calcio, así como la movilización de calcio intracelular tiendas. Si bien nuestro estudio no se prorrogó para el mecanismo subyacente (s) de la RT efecto en ASM de respuesta, nuestros resultados proporcionan pruebas del efecto del impuesto de matriculación en la afluencia de calcio. De este modo, los resultados presentados en la Figura 1 muestran que la reducción de la concentración de calcio extracelular de 2 mm a 0,2 mm suprime el efecto de RT en ASM respuesta a la acetilcolina.

En un estudio previo [9], hemos demostrado que afecta RT liberación endógena de NO. De acuerdo con estos resultados, en el presente estudio la nonselective NOS inhibidor de L-NAME-ACh aumento de las contracciones inducidas obtenidos en el 2,5 g RT, sin efecto sobre los ACh contracciones inducidas obtenidos a 0,5 g RT. Se ha demostrado mediante técnicas de inmunohistoquímica [17] y inmunoreactividad [18] que las vías respiratorias conejo expresar neuronal y la endotelial isoformas de NOS, mientras que la forma inducible de la enzima ausente es esencialmente con la tinción de Enos siendo la más intensa de las tres isoenzimas NOS . Considerando lo anterior, en el presente estudio se probó el efecto de los inhibidores específicos de inducible NOS neuronal y, SMT y 7-NI, respectivamente. Como hemos mostrado en la Figura 2, a 2,5 g RT, tanto SMT y 7-NI no tuvo ningún efecto sobre ACh inducida por las contracciones. Estos resultados demuestran que ni iNOS nNOS ni está involucrado en el aumento de la producción a 2,5 g RT.

El ENOS actividad podría ser modulada en un calcio-dependiente de forma que requiere un aumento de la concentración de calcio citosólico y la siguiente promoción de la calmodulina vinculante a Enos, y, por tanto, la actividad de la enzima [19]. Nuestros resultados demuestran que en el 2,5 g RT, la disminución de la concentración de calcio extracelular de 2 mm a 0,2 mm (Figura 3] suprime el efecto de L-NAME-ACh en las contracciones inducidas. Estos resultados sugieren que en el 2,5 g RT, NO la producción normal requiere la concentración de calcio extracelular. Los resultados arriba mencionados se encuentran en consistencia con los resultados de un estudio anterior en conejos, lo que ha demostrado que la concentración de calcio extracelular afecta el efecto modulador del epitelio traqueal ACh en las contracciones inducidas por [10]. Incluso más que existan evidencias experimentales que avalen la existencia de tensión que dependen de los canales de calcio en las células epiteliales de las vías respiratorias que contribuyen a los cambios en la concentración de calcio intracelular observado después de estimulación mecánica de la membrana plasmática [20 - 24].

En los buques, se ha demostrado que la L-arginina es la absorción que participan en la producción causadas por estímulos mecánicos, pero L-arginina no es necesaria para ACh inducida por la producción de NO [25, 26] o por el aumento de Enos actividad de fosforilación de la tirosina [5 - 7]. Los resultados del presente estudio demuestran que en el 2,5 g RT, la concentración de calcio extracelular, NEP o inhibidores de tirosina quinasa y L-arginina no alteró la tensión pasiva. En consecuencia, la presencia de precursores NO, L-arginina en el medio perfusing no alteró la capacidad de respuesta de ASM a ACh, ya sea a 0,5 g ó 2,5 g RT. Por otra parte, los inhibidores de tirosina quinasa, erbstatin A, y el Genistein no tuvo ningún efecto sobre ACh contracción inducida obtenidos en el 2,5 g RT, lo que sugiere que en conejo tráquea, fosforilación de la tirosina no participa en la producción observado en el 2,5 g RT. Con base en lo anterior, le sugerimos que RT afecta a la producción de acuerdo con la acetilcolina. En 0,5 g RT, el nivel basal de calcio intracelular no es suficiente para activar Enos, y, por tanto, la producción de células epiteliales. En 2,5 g RT, acetilcolina induce un aumento de la afluencia de calcio extracelular espacio en las células epiteliales, lo que conduce a la activación del ENOS y la producción independiente de fosforilación de la tirosina y extracelular L-arginina concentración.

Los estudios clínicos han demostrado así que la inspiración profunda puede actuar como broncodilatador y bronchoprotector agentes. El efecto protector de profunda inspiración se pierde en los asmáticos [27 - 29] y los pacientes con enfermedad pulmonar obstructiva crónica [30]. La razón de la marcada diferencia en la respuesta a la profunda inspiración entre normal y asmáticas no está claro a pesar de varios mecanismos han sido propuestos, incluida la inhibición del tono colinérgico [31], la activación de la inhibitoria nonadrenergic, noncholinergic sistema [32], así como los cambios en la organización de los elementos contráctiles de las células musculares lisas [33, 34]. Los datos disponibles a partir de ahora y los estudios anteriores de nuestro laboratorio [8, 9] sugieren que el epitelio de las vías respiratorias pueden tener un papel modulador en este proceso. Como el epitelio responde al tramo de la modulación de la actividad Enos, y por lo tanto la producción con la consiguiente reducción de las vías respiratorias de respuesta, este mecanismo de protección podría verse perjudicada en el epitelio daños observados en las enfermedades de las vías respiratorias, en particular, asma [35].