Mediators of Inflammation, 2007; 2007: (más artículos en esta revista)

Expresión de los seleccionados Integrinas y Selectins en Pénfigo ampolloso

Hindawi Publishing Corporation
Agnieszka Żebrowska [1], Anna Sysa-Jędrzejowska [1], Małgorzata Wągrowska-Danilewicz [2], Ewa Joss Wichman-[1], Anna Erkiert-Polguj [3], Elżbieta Waszczykowska [3]

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Resumen

Blister en el desarrollo de penfigoide ampolloso (PA) el resultado de la destrucción de hemidesmosomes y componentes de la membrana basal en la unión dermo-de autoanticuerpos. Moléculas de adhesión pueden participar en la patogénesis de esta enfermedad. El objetivo del estudio fue determinar la localización y la expresión de L-y E-selectins y β 1, β 3, y 4 integrinas β mediante técnicas de inmunohistoquímica en las lesiones cutáneas de 21 pacientes con BP, en comparación con 10 sujetos sanos. Expresión de L y E selectins y β 1, β 3 integrinas fue detectado principalmente en los queratinocitos basales y en el infiltrado inflamatorio en la dermis, expresión de la integrina β 4 fue irregular y se detectó principalmente en la parte dérmica de la ampolla, mientras que en el grupo control sólo débiles y única expresión de las moléculas examinado se detectó en los queratinocitos basales y células de endotelio. Los resultados obtenidos ponen de manifiesto el importante papel de determinados selectins y integrinas en el desarrollo de lesiones cutáneas en AP.

1. INTRODUCCIÓN

El desarrollo de lesiones cutáneas en el curso de penfigoide ampolloso (PA) el resultado de la destrucción de componentes de la membrana basal. Compleja estructura de esta membrana es responsable de mantener la integridad de dermo-epidérmica cruce. Dos glicoproteínas de masa molecular 230 kD (BPAG1) y 180 kD (BPAG2) son autoantigens en el penfigoide ampolloso. Estudios estructurales reveló que extracelular fragmento de BPAG2 con COOH - terminal colagenosa dominio conecta la membrana basal epidérmica con hemidesmosomes. NC16a fragmento de BPAG2, que se encuentra dentro de su fragmento extracelular, se piensa que es la parte más inmunogénica del antígeno. Encuadernación de autoanticuerpos dirigidos contra estos autoantigens, localizados en la membrana basal de la epidermis, activa una serie de inmunológicas y enzimáticas fenómenos [1, 2].

Infiltrados inflamatorios en la dermis, formado por los neutrófilos y eosinófilos, y encuadernado en vivo IgG y C3 a lo largo de depósitos de la membrana basal de la epidermis se observan. Ultraestructural estudios también confirmaron la presencia de intensas infiltrado inflamatorio a dermo-epidérmica cruce, así como la destrucción de hemidesmosomes y componentes de matriz extracelular [3]. Formación de los infiltrados es precedida por la acumulación temprana de los leucocitos, dependiendo de la actividad de moléculas de adhesión, sobre todo selectins y integrinas. Schmidt et al. [4] observó que vinculante de autoanticuerpos con BPAG2 conduce a la activación de los queratinocitos, que liberan interleuquina 6 y la interleukina 8, así como la activación del componente C5 del complemento. Mastocitos y neutrófilos activados por la misma reacción inmunológica migran a través de las paredes de los vasos sanguíneos con la ayuda de E y L selectins y secretan proteasas específicas que pueden digerir una serie de proteínas de la membrana basal. Metaloproteinasas de la matriz, liberados por células inflamatorias y queratinocitos, son finalmente responsables de la formación blister [5, 6]. La migración de las células inmunocompetentes de los vasos sanguíneos en los focos de inflamación tiene varias fases. En cada etapa de este proceso diferentes familias de moléculas de adhesión están involucrados, responsables de rodamiento, adhesión, activación, vinculante, y diapedesis de leucocitos [7].

Durante la primera etapa (de leucocitos de rodadura), vinculante y de E L selectins oligosacáridos con ligandos resultados en la denominada marginación de las células, por ejemplo, el contacto directo de los leucocitos con el endotelio. Segunda etapa, activación de leucocitos, se caracteriza por una mayor afinidad de los receptores de la integrina en los leucocitos de rodadura. Citoquinas producidas localmente en focos de inflamación causa de poner fin a las células de rodadura y de sus empujar a través del epitelio [6 - 8]. Subfamilias de integrinas, por ejemplo, β 1 y β 3, participan en la tercera fase, denominada fuerte adherencia. Durante la cuarta etapa diapedesis y la migración en los tejidos se pueden observar [6, 7, 9].

Moléculas de adhesión tienen un importante papel durante más extravascular etapas de la migración. Ellos son glicoproteínas transmembrana compuesto por extracelular, intramembrane, y citoplasmáticos dominios funcionales [7]. La integrina β 4 es, además, participan en la conexión de los filamentos de la célula a la membrana basal y la formación de hemidesmosomes. La destrucción de estos hemidesmosomes es un proceso esencial en el desarrollo de lesiones cutáneas en BP [3].

Continuación de la investigación en relación con la modulación de la actividad de determinados selectins integrinas y que están involucrados en los procesos que tienen lugar en la piel pueden contribuir al desarrollo de nuevos métodos terapéuticos para diversas dermatosis, especialmente bullosa enfermedades de la piel.

Hay pocos datos de la literatura sobre las variaciones de algunas moléculas de adhesión o los niveles séricos de exámenes en modelos animales en el penfigoide ampolloso. El objetivo del estudio fue determinar la localización y de expresión y de E L selectins y β 1, β 3, y 4 integrinas β lesional en la piel de los pacientes con penfigoide ampolloso y en la piel de personas sanas.

2. MATERIAL Y MÉTODOS

El estudio incluyó 21 pacientes con BP (15 mujeres y 6 hombres, con edades comprendidas entre los 58 y 84 años, con una edad media de 68,5) en fase activa de la enfermedad. Todos los pacientes tenían lesiones en la piel-ampollas, vesículas, pápulas, o eritema. El grupo control consistió en 10 personas sanas (5 mujeres y 5 hombres, las edades entre 19 y 49 años, edad media 42). El estudio fue aprobado por el comité de ética local de la Universidad de Medicina de Lodz.

El diagnóstico de penfigoide ampolloso se basa en cuadro clínico, así como histológicos e inmunológicos exámenes. 11 pacientes presentaban lesiones cutáneas en forma de ampollas, vesículas, picor y pápulas eritematosas, el resto de los pacientes presentan sólo con eritema.

En todos los pacientes, prueba de inmunofluorescencia directa reveló obligado en vivo IgG/C3 depósitos lineal a lo largo de la membrana basal zona. En prueba de sal división, los depósitos se observaron en la parte epidérmica de la ampolla, o ambos en epidérmica y dérmica partes. En prueba de inmunofluorescencia indirecta, anticuerpos IgG circulantes se encontraron en 17 de los 21 pacientes, mientras que la prueba ELISA (MBL, Nagoya, Japón) puso de manifiesto la presencia de anti-NC16a autoanticuerpos en 19 casos. En el examen histológico, características compatibles con el diagnóstico de BP se observaron, como neutrofílica, eosinofílica, y linfocítica infiltrados, y en 11 casos de ampollas subepidérmicas.

La inmunohistoquímica se utilizó para evaluar las expresiones de adhesins estudiado. Las biopsias para estudio inmunohistoquímico se obtuvieron a partir de la piel lesional en los pacientes y de la nuca región en controles sanos.

Parafina embebido en las secciones se utilizaron para la rutina H + E para la tinción inmunohistoquímica y en Dako Envision sistema de detección utilizando el método de inmunoperoxidasa. Los siguientes primaria anticuerpos monoclonales se emplearon: CD29 1 familia), CD61 (GPIII) (3 β familia), CD104 (4 β familia), CD62E (E-selectina) y CD62L (L-selectina), (Novocastra, Reino Unido).

Para la inmunohistoquímica embebido en parafina secciones se colocaron en placas adhesivas y secado a 56 ° C durante 24 horas, después deparaffinated en una serie de xylens alcoholes y con la disminución de las concentraciones (96%, 80%, 70%, 60%). La actividad de peroxidasa endógena se inhibió con el 3% de peróxido de hidrógeno en solución de metanol durante 5 minutos.

Con el fin de recuperar la antigenicidad de los tejidos y les permite reaccionar con anticuerpos, los siguientes procedimientos se utilizaron para cada uno de la prueba de anticuerpos: CD62E de las secciones se calienta a 0,001 M versenian de amortiguación (EDTA) de pH 8,0 en un baño de agua a 95 ° por 30 minutos; CD62L para las secciones fueron cocidos en 0,001 M versenian de amortiguación (EDTA) pH de 8,0 en horno microondas a 700 W durante 15 minutos; CD29 para las secciones se calienta 6 veces en 0,01 M de buffer citrato de pH 6,0 en microondas estufa a los siguientes niveles de potencia: 150 W (5 minutos), 350 W (5 minutos), 450 W (5 minutos), y 650 W (6 minutos); para CD61 y CD104 las secciones se calienta en Dako objetivo de recuperación de solución en un baño de agua a 95 ° durante 30 minutos. Secciones se enfría luego enjuagados en 0,05 M TRIS buffer (TBS) a pH 7,6 para 30 minutos y se incubarán durante 60 minutos a temperatura ambiente en cámara húmeda con, respectivamente, diluido anticuerpos CD62E (E-selectina) 1: 50, CD62L (L - selectina) 1: 50, CD29 1: 40, CD61 (GPIII) 1: 25, CD104 1: 50. Después de la incubación las secciones se enjuagarse dos veces en buffer TBS y Dako Envision doble sistema de visualización paso siguiente fue aplicado con el fin de visualizar el antígeno-anticuerpo de reacción.

La siguiente escala semicuantitativa se aplicó para la evaluación de la intensidad de la reacción inmunohistoquímica de CD29, CD61, CD104, CD62E, y CD62L en biopsias de piel: -: no hay reacción, +: intensidad débil en la mayoría de las células, 2 +: moderada intensidad, 3 + : Fuerte intensidad.

Expresión de integrinas selectins y fue evaluada por dos patólogos independientes utilizando Olympus BX 41 microscopio (Japón). Plenario diapositivas con todos los campos de vista microscópico se investigaron.

3. RESULTADOS

Resultados de evaluación semicuantitativo de la expresión de integrinas y estudió en selectins examen inmunohistoquímico se presentan en la Tabla 1.

3,1. Integrina β 1 (CD29)

Inmunoexpresiones de la integrina β 1 (CD29) se detectó en todos los queratinocitos basales. En muestras de piel de pacientes con BP, de intensidad media inmunoexpresiones era débil (14/21) (véase Figura 1]. Moderado expresión de CD29 se observó en 4 de 21 pacientes. En muestras de piel obtenidas a partir de voluntarios sanos expresión es muy débil y sólo se detectó en células individuales (véase la figura 2].

3,2. Integrina β 3 (CD61)

Reacción con el anticuerpo CD61 fue positivo en muestras de piel de los pacientes y fue localizado en los queratinocitos basales y focally también en otras capas de la epidermis (véase la figura 3]. La media de intensidad de inmunoexpresiones de CD61 era débil (14/21). En el control de muestras de piel, inmunoexpresiones de β 3 integrinas (CD61) no se observó.

3,3. Integrina β 4 (CD104)

Inmunoexpresiones de la integrina β 4 (CD104) se detectó en hemidesmosomes en BP muestras, así como en el control de biopsias. En biopsias de piel lesional de los pacientes, de expresión fue irregularmente esparcidos a lo largo de la membrana basal (ver figura 4], mientras que en la piel sana es regular y lineal (ver Figura 5]. La media de intensidad de expresión de CD104 en penfigoide es débil (14/21).

3,4. E-selectina (CD62E)

Inmunoexpresiones de E-selectina en muestras de piel de BP pacientes se detectó en las células endoteliales y los neutrófilos (véase la figura 6]. La media de intensidad de CD62E inmunoexpresiones en los pacientes fue escasa (17/21). En biopsias de piel sana, de un solo las células endoteliales mostraron muy débil expresión de CD62E.

3,5. L-selectina (CD62L)

Inmunoexpresiones de L-selectina se detectó en limphocytes, macrófagos y neutrófilos (véase Figura 7]. La media de intensidad de la expresión de CD62L en penfigoide es débil. En biopsias de piel sana muy débil expresión sólo se observó en solo las células endoteliales.

4. DISCUSIÓN

Pemphigoid es una dermatosis bullosa subepidérmicas en procesos patológicos que dar lugar a la desconexión entre la capa basal de la epidermis y la dermis, provocando la formación de ampollas tensas. Se demostró que la administración de conejo anti-mBP180 anticuerpos a ratones recién nacidos causas patológicas de la producción de anticuerpos, la acumulación de leucocitos, y complementar la formación de depósitos a lo largo de la membrana basal que los resultados en el desarrollo de ampollas [4, 9]. Scare datos de la literatura reveló el papel adhesivo de determinadas moléculas en la patogénesis de BP. En estudios recientes se estableció propiedades bioquímicas de metaloproteinasas y sus inhibidores de tejido y su gran afinidad por los componentes de la membrana basal. Estas enzimas son producidas por los eosinófilos y neutrófilos atraídos por la membrana basal de selectins y integrinas.

Integrinas pertenecen a las partículas que son muy importantes para el mantenimiento de la dermo-epidérmica cruce, así como la célula-célula conexiones. La falta de la integrina β 1 durante el desarrollo fetal en ratones es una mutación letal [8, 10, 11]. Genética o disfunción autoinmune de α-6 β 4 integrina causas bullosa lesiones en la piel y las membranas mucosas en el curso de enfermedades como el junctional tipo de epidermolisis bullosa o cicatricans penfigoide. Expresión de diferentes integrinas en los queratinocitos, firoblasts, las células endoteliales y la migración de las células también es necesaria para los procesos normales de cicatrización y para la aparición del fenómeno de la apoptosis [12, 13]. El aumento de expresión de integrinas se asocia con la promoción de la migración celular, la producción de metaloproteinasas, y la angiogénesis [14, 15].

La activación de diversas vías de transducción de señales depende de la familia de las integrinas, el tipo de proteínas ECM asociados, y factores estimulantes. Integrina son factores estimulantes de citoquinas, factores de crecimiento, quimiocinas, y otras moléculas de adhesión, incluidos los propios citoquinas [14 - 16]. Algunos literatura confirmar la fecha el papel de estas citocinas, quimiocinas, y ECM enzimas en la patogénesis de BP [4, 5].

Integrinas son heterodimers construir a partir de α y β cadenas conectado noncovalently que pasar a través de la membrana citoplasmática, que se une extra e intracelulares entornos [7, 17, 18]. Vinculación de una integrina ligando inicia con cascada de señalización que modula el comportamiento celular y la transcripción de genes [19]. Integrinas son los principales receptores celulares para vinculantes con los componentes de la matriz extracelular (por ejemplo, plectin, fibronectina, vitronectin, colágeno) a través de contratos especiales de corta fragmentos de proteínas y están involucradas en la adhesión intercelular de la epidermis [20, 21]. Subfamilia β 1 integrinas participan principalmente en el interacciones entre las células del tejido conectivo y las macromoléculas (por ejemplo, la fibronectina, laminina, colágeno); β 2 se asocian con la célula a célula interacciones, mientras que β 3 juegan un papel en las conexiones con ligandos como el fibrinógeno, vitronectin, thrombospondin, y von Willebrand factor [7, 18]. integrina β 1 subunidad se detectó en el superior y lateral partes de la membrana celular de los queratinocitos basales, si bien es muy rara vez observado en sus partes inferiores. Esta observación puede sugerir que esta molécula está involucrada principalmente en el mantenimiento de la conexión intercelular [20]. Moléculas que pertenecen a la subfamilia β 1 de integrinas puede llegar a ser expresado lo más tarde 2 a 7 semanas después de la estimulación de linfocitos.

En nuestro estudio, expresión de la integrina β 1 en todos los queratinocitos basales lesional en biopsias de piel de pacientes con penfigoide se observó, en comparación con señal muy débil de sólo células individuales en el grupo control, lo que revela la importante función de estimulación de linfocitos y la producción de citocinas en esta enfermedad. La expresión basal en todos los keraqtinocytes es una respuesta significativa para la infiltración de linfocitos.

3 integrina β es una glicoproteína transmembrana, expresada principalmente en las plaquetas y megakaryocytes. Se vincula con la molécula CD51, la creación de un receptor para vitronectin, y, por tanto, pasa a ser expresada en las células de muchos tejidos. Moreno et al. [11] utiliza anticuerpos monoclonales contra de esta integrina, revelando su presencia en el epitelio de ratón riñones y testículos. Estructurales y funcionales de análisis de la integrina β 3 fragmentos mostró su firme adhesivo potencial y capacidad para influir en la función de fibrinógeno, al explicar la expresión de esta integrina durante el proceso inflamatorio, así como su presencia en otras células, incluyendo células epiteliales [4, 22] .

En nuestro estudio, esta expresión de la integrina se observó solo en células epidérmicas. Señal positiva fue detectado en biopsias de piel lesional, de los queratinocitos basales o focally células de otras capas de la epidermis. Parece que el proceso inflamatorio y la destrucción de dermo-epidérmica cruce puede ser inducida por la expresión de β 3 sobre los queratinocitos, pero ese fenómeno debe ser confirmada por otros métodos de diagnóstico.

Hemidesmosomes son complejos multiproteicos responsable de la adhesión de las células epiteliales a la matriz extracelular. Estos se componen, entre otros, de 6 α β 4 integrina, BP180, CD151, y plectin [21, 23]. Los resultados de los estudios in vitro revelan que α 6 β 4 integrina desempeña un papel fundamental en el desarrollo de hemidesmosomes. Esta integrina está implicado en la conexión de los filamentos intermedios de una célula a la membrana basal y los anticuerpos dirigidos contra esta molécula inhibe tanto la creación de hemidesmosomes y la función de las estructuras existentes [23, 24]. Pemphigoid antígenos BP180 y BP230 están vinculados no sólo entre sí, pero BP230 y β 4 obligar también con BP180 [21]. Interacción de los BP180 α y β 6 integrina 4 subunidad es necesario para la estabilización de la estructura hemidesmosomes [25, 26]. Se demostró que la única interacción entre BP180 y plectin no es suficiente para hemidesmosome suplir la falta de formación α 6 β 4 integrina [21].

Interacciones complejas en las dermo-epidérmica cruce también están confirmados por otros estudios in vitro [27]. Los estudios en pacientes con oftalmológicos tipo de cicatrisans pemhigoid subrayar el papel de los anticuerpos dirigidos contra la integrina β 4. Suero forma los pacientes con penfigoide cicatrisans reconoce una proteína de masa molecular 205 kDa, por ejemplo, el de la integrina β 4. Estas proteínas no fue reconocido por los sueros de pacientes con penfigoide ampolloso o pemhigus vulgaris [28 - 30].

Bhol et al. [31] reveló que el suero de pacientes con penfigoide que tenía lesiones en la mucosa bucal se une selectivamente humanos α 6 β 4 integrina. En 48 horas con la cultura humana mucosa oral obtenida de las mejillas, este suero causó la separación de la epidermis de la membrana basal. Los anticuerpos intracellulary podrán quedar vinculadas con áreas específicas que, en consecuencia, al desarrollo de lesiones en la piel [14, 31].

Leverkus et al. [27] inmunoblot utilizando el método reveló disminución de anticuerpos "contra la reactividad BP180 y β 4 integrina que correlacionó con disminución de la actividad de penfigoide ocular presenta como resultado de tratamiento. Rashid et al. [32] examinaron sueros de 20 pacientes con membrana mucosa penfigoide en fase activa de la enfermedad y demostraron que todos los estudios vinculados con los sueros 6 integrina α subunidad en immunoprecipitation y métodos de inmunoblot. Coordinadora de la pérdida de expresión de α-6 β 4 integrina está asociada con la pérdida de adherencia a la membrana basal.

Kurpakus et al. [33] examinó el papel de α-6 β 4 en hemidesmosome formación en un modelo in vitro de la cicatrización de heridas y puso de manifiesto que los anticuerpos contra la subunidad β 4 no perturbar la migración de células epiteliales, sino que inició antes de la interrupción assemblied hemidesmosomes. Nueva hemidesmoses también ya no forman anticuerpos contra y 6 α β 4 integrina completamente aislado células epiteliales de la zona de cicatrización.

Nuestro estudio ha revelado la debilidad, sino lineal y regular la expresión de la integrina β 4 en biopsias de piel de personas sanas. Esa expresión demuestra que la presencia de esta molécula es constitutiva de anclaje en estructuras de la epidermis. Sin embargo, en el curso de delaminación inmunológica de la epidermis en BP, mediada por anticuerpos dirigidos contra los componentes de la membrana basal y provocada por una cascada de citocinas y reacciones enzimáticas, esta expresión fue cambiado de manera significativa. Irregular y focal expresión de esta integrina en el infiltrado inflamatorio y ampollas puede reflejar la destrucción de la dermo-epidérmica cruce.

Selectins pertenecen a la primera familia de moléculas de adhesión que iniciar diapedesis, por ejemplo, laminación de leucocitos. Esta familia abarca tres el transporte de glicoproteínas con estructura similar: leucocitos (L), plaquetas (P), y del endotelio (E) selectina. Selectins están involucrados en el reclutamiento de leucocitos a los focos inflamatorios y en las etapas iniciales de la inflamación desempeñar un papel en la rodadura de leucocitos en el endotelio de los vasos sanguíneos [18].

E-selectina está presente en las células endoteliales estimuladas. La producción de esta molécula es inducida por una endotoxina bacteriana, citoquinas, la trombina, o factor de necrosis tumoral α (TNF α). Expresión de E-selectina puede observarse sólo en los focos de inflamación [18]. En nuestros estudios, expresión de esta selectina se observó en las paredes de los vasos sanguíneos, ligeramente más débil en los neutrófilos. Se confirma el papel de la E-selectina en el proceso inflamatorio y el desarrollo de cambios patológicos en el penfigoide.

D'Auria et al. [34] en un estudio preliminar examinó la concentración sérica de soluble E-selectina en penfigoide y pénfigo vulgar pacientes y reveló su aumento significativo en los pacientes en comparación con el grupo control, así como correlación significativa con una serie de lesiones en la piel. En el curso de la terapia, tanto la gravedad de las lesiones en la piel y la concentración de selectina estudiados disminuyó de forma paralela, lo que puede ser la utilidad de E-selectina como marcador de la eficacia del tratamiento.

L-selectina es constitutivamente presente en la superficie de leucocitos y desaparece después de su estimulación. Tiene un papel importante en el reclutamiento de neutrófilos a los focos de inflamación y los linfocitos adherencia a las células endoteliales de los vasos sanguíneos en los ganglios linfáticos periféricos. La forma soluble de esta molécula es probablemente implicados en la regulación de los procesos de adhesión [3, 18, 35]. Basándose en el hecho de que el proceso inflamatorio se asocia con la estimulación de leucocitos, menor expresión de L-selectina en pacientes en comparación con el grupo control se esperaba en nuestro estudio. Inmunoexpresiones de L-selectina, sin embargo, fue observada en los linfocitos, macrófagos y neutrófilos. Puede resultar que no todas las células inflamatorias son estimulados simultáneamente y algunos de ellos todavía mantienen la L-selectina en la superficie antes de su desquamation.

La literatura reciente de datos, así como los resultados de nuestros estudios confirman el papel de las integrinas selectins y en la patogénesis de penfigoide. El esclarecimiento del papel de las células inflamatorias, los mediadores solubles, moléculas de adhesión, y vías de transducción de señales en la patogénesis de las enfermedades bullosa puede ser útil en el desarrollo de nuevas terapias dirigidas. Una amplia investigación se ha centrado en la modulación de la actividad de las moléculas adhesivas. Entre las nuevas modalidades terapéuticas, anticuerpos monoclonales humanizados contra moléculas de adhesión están en la primera fase de ensayos clínicos [36].

Este estudio fue financiado por los proyectos de investigación de la Universidad de Medicina de Lodz, Polonia, 503-1019-1 y 503-8019-1 y Gobierno polaco, 503-280-11.