Infectious Diseases in Obstetrics and Gynecology, 2007; 2007: (más artículos en esta revista)

Efecto protector vaginal de Lactobacillus paracasei CRL 1289 contra la infección urogenital Producido por Staphylococcus aureus en un modelo animal de ratón

Hindawi Publishing Corporation
Gabriela Zárate [1], Viviana Santos [2], María Elena Nader-Macias [1]

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Resumen

Urogenitales infecciones de origen bacteriano tienen una alta incidencia entre la población femenina mundial en edad reproductiva. Lactobacilos, los microorganismos predominantes de la microbiota vaginal saludable, han demostrado un efecto protector contra la colonización y sobrecrecimiento de patógenos urogenitales que el aumento de interés para la inclusión de los probióticos en los productos destinados a restablecer el equilibrio urogenital. En el presente trabajo, se determinó en un modelo animal de ratón la capacidad de Lactobacillus paracasei CRL 1289, una cepa humana vaginal con propiedades probióticas, para prevenir la colonización vaginal uropathogenic de una cepa de Staphylococcus aureus. Seis semanas de edad, las mujeres ratones BALB / c, sincronizada en su ciclo estral, fueron inoculados por vía con dos dosis de 10 9 lactobacilos desafiante ante ellos con una dosis única de 10 5 o 10 7 UFC de S. aureus. La colonización vaginal de ambos microorganismos y el efecto sobre la estructura vaginal se determinaron a los 2, 5 y 7 días después de la inoculación de patógenos. Control de ratones y los impugnados sólo con el agente patógeno mostró un insignificante lactobacilos población, mientras que los lactobacilos 10 5 / ml de homogenado vaginal se recuperaron a los 2 días después del desafío de la L. paracasei CRL 1289 y los probióticos + grupos de patógenos, disminuyendo esta cifra en los días siguientes. El tratamiento con L. paracasei CRL 1289 disminuyó considerablemente el número de estafilococos se recuperó a las 2 y 5 días en los ratones fueron retados con sólo 10 5 UFC de agente patógeno. La inoculación de S. aureus produjo una notable respuesta inflamatoria y alteraciones estructurales en la mucosa vaginal que disminuye de forma considerable cuando los ratones fueron protegidas con L. paracasei CRL 1289. Los resultados obtenidos sugieren que esta cepa Lactobacillus podría prevenir la aparición de infecciones urogenitales por interferir con la colonización del epitelio de uropathogenic S. aureus.

1. INTRODUCCIÓN

Infecciones del tracto urogenital de origen bacteriano tienen una alta incidencia entre la población femenina mundial en edad reproductiva. Una gran proporción de estas enfermedades, como la vaginosis y las infecciones del tracto urinario son causados a menudo por agentes patógenos que surgen a partir de la microbiota intestinal y ascender a lo largo de periné a la vagina y luego a la uretra y la vejiga [1]. Aunque los antibióticos han sido ampliamente utilizadas como una terapia muy eficaz para el tratamiento de estas infecciones bacterianas, el aumento de la resistencia a los medicamentos de los agentes patógenos urogenitales hace imperativo el desarrollo de alternativas terapéuticas.

En mujeres sanas, la microflora vaginal está dominado por especies de lactobacilos, con un nivel de 10 7 -10 8 UFC g -1 de líquido, que ejercen una influencia significativa sobre la microbiología del ecosistema [2]. Se ha observado que los lactobacilos indígenas prevenir el sobrecrecimiento y la invasión de bacterias patógenas [3] por una combinación de exclusión competitiva, la competencia por nutrientes, y la liberación de sustancias antimicrobianas, tales como el peróxido de hidrógeno, ácidos orgánicos, bacteriocinas, y biosurfactantes [3 - 6 ]. En consecuencia, una disminución de los lactobacilos vaginales ha sido directamente asociados con un aumento en la incidencia de los genitales y las infecciones urinarias [7 - 9]. Por esta razón, hay un creciente interés en la utilización de humanos como los lactobacilos probióticos que restaurar y mantener una flora normal vaginal y prevenir la recurrencia de la enfermedad por la formación de un pellicle en el epitelio vaginal como una barrera biológica contra la colonización de bacterias patógenas. En este sentido, estudios previos han informado de que los lactobacilos adhesivo puede inhibir in vitro la adhesión de patógenos tales como Escherichia coli, Gardnerella vaginalis, Candida albicans, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus y Streptococcus agalactiae a las células epiteliales urogenitales [5, 10 -- 13].

Teniendo en cuenta el objetivo de desarrollar una formulación de probióticos para la prevención y el tratamiento de infecciones del tracto urogenital, nuestro grupo de investigación ha aislado e identificado los lactobacilos vaginales de mujeres sanas de la ciudad de Tucumán en Argentina [14]. Las cepas fueron ampliamente caracteriza por su probióticas y tecnológicas y algunas características prometedoras propiedades como adherencia, auto y coaggregation habilidades, peróxido de hidrógeno, como bacteriocina sustancias, ácidos orgánicos y la producción se informó de [15 - 18]. Propiedades tecnológicas pertinentes, por ejemplo, las condiciones óptimas para la producción de sustancias antimicrobianas y la viabilidad y las propiedades biológicas después de su transformación, se determinó también para determinadas cepas [19 - 24].

Lactobacillus paracasei LCR 1289 es un seleccionado humanos vaginal cepa seleccionada por su potencial probiótico, ya que es capaz de inhibir el crecimiento de uropathogenic Staphylococcus aureus in vitro de la liberación de H 2 O 2 [20], y su adherencia a las células epiteliales vaginales de la exclusión y la competencia para receptores específicos [24]. Staphylococcus aureus es un importante patógeno oportunista que puede causar una variedad de locales y sistémicos que van desde las infecciones de la piel abscesos, hueso y tejidos blandos infecciones quirúrgicas , Sepsis, endocarditis invasoras, y síndrome de shock tóxico (SST) [25]. TSS es una extensión geográfica la enfermedad que afecta principalmente a jóvenes sanos menstruando mujeres, especialmente aquellos que utilizan tampones [26].

El objetivo del presente trabajo fue determinar, en un modelo animal de ratón, la capacidad de Lactobacillus paracasei CRL 1289 para prevenir la colonización vaginal de uropathogenic Staphylococcus aureus.

2. MATERIAL Y MÉTODOS
2,1. Microorganismos y condiciones de crecimiento

Lactobacillus paracasei CRL 1289 fue aislado originalmente de frotis vaginal de mujeres sanas [14] y se había caracterizado por su probióticas y tecnológicas propiedades [15, 20, 22 - 24]. La humanos uropathogenic cepa de Staphylococcus aureus utilizados en este estudio fue proporcionado amablemente por el Instituto de Microbiología "LuisVerna" de la Universidad de Tucumán, Argentina, y fue aislada de orina patológico. Antes de uso experimental, cada cepa almacenados en la leche de extracto de levadura a -20 ° C se propagó en LAPTg caldo (1,5% de peptona, 1% tryptone, el 1% de glucosa, 1% extracto de levadura, y el 0,1% de Tween 80, pH 6,8) [ 27] a 37 ° C y subcultured por lo menos dos veces en este medio cada 12 horas. Lactobacilos fueron cultivadas bajo condiciones estáticas, a fin de evitar los efectos perjudiciales de oxígeno estafilococos que se incubaron con agitación a 100 rpm.

2,2. Animales

Seis semanas de edad, las mujeres ratones BALB / c de la colonia de inbreed CERELA (Centro de Referencia para Lacobacilos), cada uno un peso de 25 a 30 g, se utilizaron durante toda la investigación. Los animales fueron alojados en jaulas de plástico y alimentadas ad libitum con una dieta equilibrada convencional, el mantenimiento de sus condiciones ambientales constantes. Todos los animales fueron sincronizados en su ciclo estral con una dosis única intramuscular de 0,5 mg de estradiol valerate (Progynon Depot. Schering Laboratories) y asignados aleatoriamente a los siguientes grupos experimentales: (1) grupo tratado con lactobacilos, (2) lactobacilos + patógeno tratados grupo, y (3) patógeno grupo tratado. Cinco animales fueron utilizados como control nontreated grupo sincronizado. El CERELA Comité de Ética aprobado el protocolo utilizado para los estudios con animales.

2,3. Microorganismos procedimiento de inoculación

Un espontáneo cepa resistente a rifampicina obtenidos por placas L. paracasei CRL 1289 en Rogosa agar (Merck), complementado con 150 μ g / mL de rifampicina fue utilizada para inocular los ratones. La cepa resistente mostró exactamente las mismas propiedades de la cepa original. Culturas de la noche a la mañana los lactobacilos y estafilococos Laptg crecido en el caldo (12 horas, 37 ° C) fueron centrifugadas (10 000 g, 10 minutos, 4 ° C), se lava dos veces con solución salina estéril, y se incorporan en glycogelatin óvulos en una concentración de 10 9 UFC de los lactobacilos y 10 5 y 10 7 UFC de S. aureus por cada óvulo. La base de preparación de los óvulos se obtuvieron mediante la mezcla de gelatina 21% y 58% glicerol en agua destilada. Esta matriz fue esterilizado a 121 ° C durante 15 minutos, y se completará con el 0,5% de ácido ascórbico y las suspensiones de microorganismos en una proporción 1: 5. Cuarenta y ocho horas después de la sincronización de estradiol, los animales de los grupos 1 y 2 fueron inoculados por vía con dos dosis de 10 9 lactobacilos (con 24 horas de intervalo entre sí). En el tercer día, los animales del grupo 2 y los que pertenecen al grupo 3 fueron retados con una dosis única de 10 5 o 10 7 UFC de S. uropathogenic aureus. Figura 1 muestra la inoculación protocolo utilizado.

2,4. Bacteriana vaginal en homogeneizado

A las 2, 5 y 7 días después de la inoculación de patógenos, los animales fueron sacrificados por dislocación cervical. La vagina de cada animal fue retirado aséptica, situado en el 0,5% de peptona de agua, y homogeneizada con un teflón pestle. Serial diez veces diluciones de este homogenado chapada en Rogosa agar (LBS, Merck); Rogosa agar suplementado con 150 μ g / mL de rifampicina y agar manitol salado (MSA, Britania) por cuenta de bacterias ácido-lácticas, L. paracasei CRL 1289, y S. aureus, respectivamente. El LBS placas fueron incubadas 72 horas, bajo las condiciones que microaerophilic MSA placas fueron incubadas aeróbicamente.

2,5. Citológico e histológico estudios

El estudio citológico e histológico se llevaron a cabo evaluaciones de microscopía de luz. Para estudios citológicos, 50 μ l de exudados vaginales fueron recolectados con una punta de micropipeta, repartidas en portaobjetos de vidrio, y teñidas con Giemsa. Para el estudio histológico de las estructuras, las vaginas se aséptica eliminado, fija con un 10% de paraformaldehído durante 24 horas a temperatura ambiente y, a continuación, embebidos en parafina según la norma métodos histológicos [28]. Serial parafina de las secciones 4 μ m fueron teñidas con hematoxilina-eosina y observada a 40X.

2,6. El análisis estadístico

Los resultados se expresan como el valor medio ± desviación estándar de los datos obtenidos a partir de tres animales en cada una de las muestras tiempo de dos experimentos independientes. Diferencias significativas entre los medios fueron determinados por el test de Tukey después del análisis de varianza (ANOVA) con Minitab Programa de Estadística, la liberación de Windows 12. Un valor de p <.05 fue considerado estadísticamente significativo.

3. RESULTADOS

Figura 2 (a] muestra la cuenta viable de los lactobacilos y la Figura 2 (b] los de estafilococos en el vaginal homogeneizado de Balb / c ratones en diferentes épocas de muestreo después de la inoculación de probióticos L. paracasei CRL 1289 y uropathogenic S. aureus. Sincronizado nontreated ratones y los impugnados sólo con el agente patógeno (Grupo 3) mostró una insignificante población de lactobacilos. Por otro lado, los lactobacilos 10 5 / ml de homogenado vaginal se recuperaron del grupo inoculado sólo con probióticos L. paracasei CRL 1289 (Grupo 1) y los probióticos + patógeno grupo (Grupo 2) a los 2 días después del desafío. Sin embargo, este número disminuyó progresivamente en los días siguientes (véase la figura 2 (a)].

Se refiere al número de agentes patógenos recuperado de ratones, grupo control y el grupo tratado con lactobacilos (Grupo 1) fueron casi agotados de estafilococos población (Figura 2 (b)]. La inoculación de 10 7 UFC de S. aureus produce una alta y constante colonización de los patógenos que no fue impedido por el pretratamiento con lactobacilos (resultados no se muestra). Sin embargo, el tratamiento con L. paracasei CRL 1289 anterior a la infección por el patógeno disminuyó significativamente el número de estafilococos se recuperó a las 2 y 5 días en los ratones fueron retados con 10 5 UFC del agente patógeno (Figura 2 (b)].

La Figura 3 muestra el frotis vaginal teñidas con Giemsa de los ratones inoculados con los lactobacilos y estafilococos. No citológico modificaciones se observaron después de la administración de L. paracasei CRL 1289. Por el contrario, la inoculación de S. aureus produjo una notable respuesta inflamatoria (Grupo 3) con una alta infiltración de células polimorfonucleares en la secreción vaginal. Este efecto se redujo de forma considerable cuando los ratones fueron previamente protegidos con L. paracasei CRL 1289.

No hay alteraciones histológicas fueron producidos por los lactobacilos inoculación (Figura 4], mientras que importantes modificaciones estructurales de la mucosa vaginal, con la desaparición de la capa de queratina y neutrophiles infiltración en el epitelio, se observaron en el grupo inoculado únicamente con S. aureus (Figura 4]. Un efecto intermedio se observó en ratones protegidos con L. paracasei CRL 1289.

4. DISCUSIÓN

El potencial de uso humano como los lactobacilos probióticos asignado a restablecer y mantener un sano el tracto urogenital representa una alternativa prometedora a la quimioterapia convencional [6, 29]. En la actualidad, una gran cantidad de evidencia científica apoya, por in vitro e in vivo, estudios, la eficacia de los probióticos para prevenir el archivo adjunto o estimular la eliminación de enteropatógenos de las células intestinales [30, 31]. Los probióticos se han utilizado con éxito para prevenir y tratar las enfermedades gastrointestinales causadas por tratamientos antibióticos, rotavirus, las enterobacterias y clostridios infecciones [32]. Sin embargo, hay mucho menos antecedentes sobre la prevención y efectos terapéuticos de los probióticos contra las enfermedades del tracto urogenital. Algunos estudios in vitro han informado de la inhibición del crecimiento de patógenos y la adhesión a células uroepithelial de lactobacilos [10, 12, 13, 21, 24, 33]. Este "anti-infecciosos" mecanismo implica la liberación de los antimicrobianos y el bloqueo de uropatógenos la adhesión de ambos steric obstáculo para la competencia y los receptores [10, 34]. En lo que respecta a los estudios in vivo, se ha informado de que los lactobacilos vaginales impidió la colonización del tracto urinario de los ratones de E. coli, pero no fueron capaces de ejercer importantes efectos terapéuticos [35]. En los seres humanos, la eficacia clínica urogenital para el mantenimiento de la salud y la prevención de enfermedades se ha demostrado sólo para Lactobacillus rhamnosus GR-1 y búlgaros RC-14 [1]. Ambas cepas probióticas lactobacilos colonizado el tracto urogenital de la instilación vaginal y oral consumo, y fueron capaces de reducir el riesgo de IU y curar la vaginosis bacteriana [36, 37].

En el tracto urogenital saludable de las mujeres adultas, que se supone que los indígenas lactobacilos excluir la colonización de bacterias patógenas de antagonistas compuestos y / o de ocupación / enmascarar su potencial sitios de unión a la mucosa [10, 38]. Sin embargo, en un entorno agotado los lactobacilos, como una infección del tracto urogenital, se debe esperar que los lactobacilos exógenos probióticos tienen la capacidad para competir por los mismos receptores y desplazar a los agentes patógenos previamente adjunta [11]. En un estudio anterior, se observó que determinados lactobacilos vaginales interferido en distinta medida con el crecimiento y la adhesión a las células epiteliales vaginales de algunos patógenos del tracto genitourinario [21, 24]. Entre estas cepas, Lactobacillus paracasei CRL 1289 fue capaz de disminuir, en un nivel significativo, la adherencia de S. aureus por la exclusión y los mecanismos de competencia [24], así como para inhibir el crecimiento de su H 2 O 2 producción [15, 20]. Basándose en estos resultados, se evaluaron en el presente trabajo la capacidad de estos lactobacilos para prevenir la colonización vaginal de S. aureus en un modelo animal, y la protección alcanzado.

Los resultados obtenidos mostraron que los lactobacilos no son una población dominante de la microbiota vaginal de la Balb / c ratones utilizados en este estudio que los humanos y Lactobacillus paracasei CRL 1289 fue capaz de colonizar transitoriamente el murino del tracto vaginal, ya que los lactobacilos 10 5 / ml de la vagina homogenado se recuperaron después de 2 días de la inoculación, pero disminuyó progresivamente en los días siguientes. Sin embargo, los humanos S. uropathogenic aureus cepa fue capaz de producir una infección muy fuerte cuando fue inoculado a 10 5 o 10 7 UFC niveles, produciendo alteraciones morfológicas significativas de la estructura de la mucosa, principalmente la infiltración de células polimorfonucleares que apareció como capsulated grupos de células en el epitelio vaginal y lámina propia, y la completa desaparición de la capa de queratina. Lactobacillus paracasei CRL 1289 no fue capaz de proteger ratones retados con 10 7 UFC de S. aureus, pero efectivamente disminuyó el número de estafilococos en la vagina y el daño causado, cuando la dosis de infectar el agente patógeno fue 10 5 UFC.

En conclusión, los resultados preliminares obtenidos en este trabajo sugieren que L. par acasei LCR 1289 puede prevenir la aparición de infecciones urogenitales causadas por S. uropathogenic aureus interferir con la colonización del epitelio (posiblemente a través de barrera y los mecanismos de interferencia) y fomentar más los estudios in vivo, tales como ensayos clínicos diseñados para poner a prueba su capacidad para prevenir y gestionar las infecciones del tracto urogenital en las mujeres.

Este documento fue apoyado por las becas de CONICET-Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas de Argentina. Las cepas de Lactobacillus se otorgaron licencias a ANIDRAL (Italia) para uso comercial.