Nucleic Acids Research, 2007; 35(6): 1833-1841 (más artículos en esta revista)

Splicing alternativo y el análisis bioinformático de la U12 de tipo intrones

Oxford University Press
Wen-Cheng Chang [1], Yung-Chen Chia [2], Kuo-Ming Lee [2], Woan-Yuh Tarn [1]

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Resumen

U12-intrones tipo existen, aunque rara vez, en una gran variedad de organismos multicelulares. Empalmes de U12-intrón que contengan precursores mRNAs se lleva a cabo en la U12 de tipo spliceosome que es distinta de las principales U2-tipo spliceosome. Debido a la incompatibilidad de estos dos spliceosomas, splicing alternativo con un U12-intrón tipo puede dar lugar a un impacto relativamente complicado en la expresión génica. Se estudiaron alternativas U12-intrón tipo de empalme en un intento de ganar más mecanicista ideas. En primer lugar, caracterizado mutuamente excluyentes exón selección de los genes humanos JNK2, lo que supone una inusual intrón posesión de la U12 de tipo 5 'del sitio de empalme y el U2 de tipo 3' empalme sitio. Hemos demostrado que el largo y evolutivo del tracto polypyrimidine conservadas de este híbrido intrón proporciona importantes señales para la inclusión de su alternativa exón abajo. Además, hemos examinado los efectos de los polimorfismos de nucleótido único en los humanos WDFY1 U12-intrón tipo de pre-mRNA de empalme. Estos resultados proporcionan mecanicista en los empalmes de selección de sitios de U12-intrón tipo de empalme. Finalmente examinar los posibles efectos de empalme de un tipo U12-intrón con defectos genéticos o dentro de un conjunto de genes que codifican los factores de transformación del ARN en la expresión génica global.

INTRODUCCIÓN

En eucariotas superiores, la mayoría de los genes están interrumpidos por múltiples intrones que son extirpados de los precursores del mRNA (pre-mRNA) durante la expresión génica. Dos tipos distintos de los intrones, a saber, U2 y U12, se encuentran en los genomas de organismos multicelulares [revisado en (1, 2]]. U2-tipo predominan los intrones, mientras que el U12 de tipo intrones se producen con una frecuencia mucho menor y están ausentes en algunas especies como Caenorhabditis elegans (3]. Los dos tipos intrón se distinguen por su sitio de empalme y rama de sitio secuencias. Casi todos los pre-ARNm intrones han GT y AG dinucleotides a sus 5 'y 3' límites, respectivamente, con la excepción de un subgrupo con el AT-AC terminal de residuos (3]. El U2-y-U12 tipo intrones son empalmados por sus respectivos spliceosomas. Los dos tipos de la spliceosome compartir un pequeño nuclear ribonucleoprotein (snRNP), U5, pero cada uno tiene otros cuatro específicos snRNPs: U1, U2 y U4/U6 en el U2 de tipo spliceosome, y su baja abundancia funcionales análogos, es decir, U11, U12 y U4atac/U6atac en la U12 de tipo spliceosome [revisado en (1, 2]]. Cada snRNA diferencia de sus análogos en la secuencia primaria, pero que comparten una notable similitud en la estructura secundaria (1]. Por otra parte, los dos spliceosomas contienen un gran conjunto común de componentes de proteínas, y la intrincada red de la ARN-RNA interacciones es sorprendentemente similares en cada spliceosome [revisado en (1, 2, 4, 5]]. Sin embargo, el individuo spliceosomas sólo puede catalizar la retirada de sus afines intrones.

El U2-y U12 que dependen de los sistemas de empalme podría haber evolucionado independientemente en distintos linajes y luego se fusionaron en un eukaryote progenitoras linaje a la fusión (6]. Estos dos mecanismos de empalme también pueden haber convergido evolutivamente para compartir los factores comunes de proteínas (4]. Otro modelo sugiere que los dos tipos de spliceosomal intrones puedan haber surgido a partir de dos diferentes auto-empalme intrones del grupo II [revisado en (7]]. Sin embargo, la escasez de la U12 de tipo moderno intrones en los organismos puede ser el resultado de sus menos preciso y más lento de empalme en comparación con los U2 de tipo intrones [revisado en (5]]. De este modo, el U12 de tipo intrones podrían tener una tendencia a convertir a su secuencia vagamente definido U2-tipo de empalme sitio / rama sitios a través de mutaciones durante la evolución los cambios (6].

Análisis filogenético revela que-U12 intrones tipo están presentes en genes que codifican homóloga de diferentes especies que se han ido distanciando más de 600 millones de años [revisado en (5]]. La presencia de intrones homóloga de genes en los miembros de la familia es en gran parte debido a la amplificación de genes durante la evolución (6, 8]. Curiosamente, algunos de tipo U12 intrones prevalecer en conjuntos de genes implicados en determinados procesos celulares, como por ejemplo el barrio de Ras-Raf vía de señalización (8]. Tal vez el empalme de estas U12-intrones tipo podría regular la expresión de sus genes de acogida [revisado en (5]]. Por otra parte, la persistencia de la U12 de tipo intrones durante la evolución pone de relieve su papel indispensable en funciones celulares [revisado en (5]].

Aquí, una exploración bioinformática ha identificado una docena de nuevos casos de splicing alternativo que participen U12-tipo intrones, aunque algunos pudieran derivarse de la utilización aberrante de los sitios de empalme (8]. Resultados experimentales indican que las mutaciones en cualquiera de nucleótidos de la terminal-U12 tipo podría activar intrones splicing alternativo a través de crípticos empalme de uso del sitio (9, 10]. Preferencial activación de críptico 3 'sitios de empalme (en lo sucesivo abreviada a SS) sugiere que el tipo U12-spliceosome tiene menor rigor en el reconocimiento de la 3'SS, en comparación con el 5'SS (9-11]. En particular, una mutación en el tipo U12-intrón 5'SS del gen supresor tumoral LKB1/Serine/threonine-protein quinasa 11 (STK11) está asociada con el trastorno autosómico dominante Síndrome de Peutz-Jeghers (PJS), lo que subraya la importancia de nucleótidos polimorfismos de tipo U12-intrones en las enfermedades humanas que impliquen splicing alternativo (10]. Un intrigante caso se identifica a c-Jun N-terminal quinasa (JNK) / SAPK genes, en la que el intrón entre dos alternativas exones contiene la U12 de tipo 5'SS y el U2 de tipo rama sitio y 3'SS (12 -- 14]. Se prevé que este híbrido intrón podría conducir mutuamente excluyentes selección de su acompañamiento exones (13, 14]. Sin embargo, el mecanismo de empalme detallado aún no se ha deciphered.

Este estudio fue destinada a comprender los mecanismos de splicing alternativo de tipo U12-intrones. Hemos examinado experimentalmente el papel de cis-elementos dentro de la U2-U12 intrón híbridos de humanos JNK2 (c-Jun N-terminal cinasa 2) en el exón alternativa de selección y el efecto de tipo U12-intrón por empalme polimorfismos del ser humano WDFY1 pre - mRNA. JNKs tan importante función de señalización quinasas celulares en una gran variedad de procesos fisiológicos [(15] y referencia]. WDFY1 que contengan WD40 repite una y phosphatidylinositol 3-fosfato (Pi3) vinculante FYVE de tipo dedos de zinc (16, 17] puede actuar como un factor de señalización en la Pi3 quinasa vías de señalización. Por lo tanto, es interesante comprender si U12-intrón tipo de empalme que su impacto sobre la expresión génica. Por último, se discute la presencia de U12-tipo intrones en genes que codifican pre-mRNA factores de empalme y su posible impacto sobre la expresión génica.

MATERIAL Y MÉTODOS
Análisis computacional de tipo U12-intrones

Para ampliar la base de datos de la U12 de tipo intrones proporcionada por Levine y Durbin (8], hemos realizado una búsqueda de texto basado en gran medida de sus resultados. Ambos 5 'y 3' empalme de las secuencias de sitio de 404 U12-intrón tipo de entradas se extrajeron de la suplementarias Cuadro 1 de Levine y Durbin (8] y sometido a una búsqueda en NCBI ( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ ) Y UCSC ( http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat ) Para obtener información adicional incluyendo las estructuras de genes y empalme de las secuencias de sitio. Hemos anotado manualmente cada putativo U12-intrón tipo y confirmó ~ 390 miembros. A continuación, se realizaron búsquedas de nuevas U12 intrones de tipo principalmente en el seno de sus familias de acogida de genes utilizando el NCBI y Ensembl Gene Gene ( http://www.ensembl.org/Homosapiens/index.html/ ), Bases de datos. Esta búsqueda identificó 110 ~ antes no humanos-U12 tipo intrones, dando una colección de ~ 500 miembros. Tenga en cuenta que un sitio de empalme-análisis fue realizado recientemente en cinco especies identificadas y 671-U12 tipo intrones en el genoma humano (18].

Se obtuvieron las secuencias de humano y JNK2 su orthologs de Ensembl (GeneView), anotada y el híbrido intrón y su acompañamiento de los exones usando ExonView y GeneSeqView (Ensembl). La familia JNK genes de otras especies se obtuvieron a partir de la orthologs hipervínculos, y su exón / intrón límites fueron confirmados mediante el uso de la UCSC Genoma Bioinformática página web. Filogenéticos de conservación de los híbridos intrones se analizó mediante el programa AlignX de VectorNTI (Invitrogen), con un tamaño de la ventana de visualización 23. Por otra parte, la búsqueda de polimorfismos de nucleótido único (SNP) de la U12 de tipo intrones, 50 U12-intrón tipo de genes que contiene fueron analizados mediante el uso de SNPper ( http://snpper.chip.org/ ) Y Ensemble GeneSeqView.

Plásmido construcción

El JNK2 minigene reportero fue construido como sigue. Cuatro fragmentos de PCR el gen humano JNK2 fueron amplificados de HEK 293-célula con el ADN genómico sitio de restricción de etiquetado primers. Tres fragmentos que figuran ya sea un solo exón (5, 7 y 8) o dos exones alternativos (6a y 6b) con el híbrido intrón en el centro. Cada fragmento también se extiende aguas arriba y aguas abajo de la intronic ~ secuencias de 120-200 pb. Los fragmentos de PCR fueron clonados y ligated en pcDNA3.1 + (Invitrogen), y la secuencia de ADN de la resultante minigene fue confirmada por secuenciación. Para alterar las dos alternativas exones con sus respectivas secuencias de acompañamiento intrón (Swap-E + I), la PCR fragmento que contiene el exón 6 ter con una parte de los intrones se ligated río arriba, el fragmento que contiene el exón 6 bis. Para alterar el exón sola región, hemos diseñado dos 108-bp primers, el exón 6 bis adelante y revertir el exón 6 ter. Estos dos primers abarcaba todo el exón 6a y 6b secuencias, respectivamente, y las mutaciones que figuran en sus 5 'fin de crear un sitio NCO II para la clonación. PCR se realizó con estos dos primers utilizando el JNK2 minigene como la plantilla. El producto se utilizó como un vector columna vertebral para acomodar el híbrido intrón a través de la ingeniería NCO II sitios; el minigene resultante se denominó-Swap Eonly. A PCR-método basado en (QuikChange; Stratagene) se utilizó para generar polypyrimidine (Py)-truncado reporteros, el resultado Δ Py1, Py2 Δ Δ Py y reporteros carecen de nucleótidos 46-62, 9-40 y 9-62, aguas arriba del exón 6 ter, respectivamente . El reportero AdPy se obtuvo mediante la inserción de la secuencia del tracto Py (5'-tcatacttatcctgtcccttttttttcc) derivados a partir del primer intrón de los principales fines de adenovirus en el gen Δ Py reportero.

Para construir la WDFY1 minigene reportero, de células HeLa ADN genómico se utilizó como modelo para amplificación por PCR de cuatro fragmentos de WDFY1; cada fragmento que abarca un solo exón (4 a 7) con su acompañamiento intrón ~ secuencia de 200 pb. Los productos de PCR fueron debidamente ligated y clonado en el vector pcDNA3.1 +, y su secuencia de ADN fue confirmada. Exógenos U12 snRNA se expresó de la pU12-DIR2 vector bajo el control de los nativos promotor y terminador de la U12 de genes (19); nivel de expresión de la exógenos U12 snRNA se ~ 4 veces más alto que el de la endógena uno (19] . Sitio de mutagénesis dirigida (QuikChange) se realizó para presentar el deseado mutaciones en el WDFY1 minigenes y pU12-DIR2. El mutante WDFY1 minigenes utilizados en este estudio fueron 5 '+ 6CU, B-4CU, B-4CA, B-4CG y 5'Bdm (véase la sección Resultados para más detalles). El U12 snRNA mutante que figuran los cambios en los nucleótidos 5 (C A) y 22 (G U).

En el ensayo in vivo de empalme

HeLa, HEK 293 y N2A células fueron cultivadas en Dulbecco modificada de Eagle el medio suplementado con 10% de suero fetal bovino (SFB) y la penicilina y la estreptomicina / glutamina (Invitrogen). P19 células se han mantenido en medio Alpha (Invitrogene) que contiene 7,5% de suero de ternera bovinos y el 2,5% de SFB. Por el en vivo de empalme de ensayo, ~ 6 × 10 5 células HEK 293 fueron transfectadas transitoriamente con 1,6 μ g de minigene informó utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen) durante 24 h. Para examinar el efecto compensatorio de snRNA exógenos U12, 1 μ g de la periodista y 3 μ g de la U12 snRNA vector de expresión se co-transfectadas. Para analizar los productos de empalme, ARN total fue extraído utilizando el reactivo TRIzol (Invitrogen) y se convierte en primera línea de cDNA superíndice III utilizando la transcriptasa inversa, ya sea con oligo dT (12-18 dores; Invitrogen) o minigene específicos de BGH (5'- tagaaggcacagtcgagg; Invitrogen) como primer. Para detectar WDFY1 transcripciones, RT se ha realizado mediante el BGH primer seguido mediante amplificación por PCR con cebadores 5'-gctagcatggaatttcacgtttctg (exón 4; adelante) y 5'-ctcgagtcaatgatggccctgaag (exón 7; inversa). En el reverso de primers fue de 5 'final marcado con 32 P utilizando T4 polinucleótido-kinasa (New England BioLabs) y 10 000 cpm (~ 10 8 cpm por μ g) del primer etiqueta se utiliza para cada reacción de PCR. Los productos de PCR fueron analizados por electroforesis en una desnaturalización del 6% en gel de poliacrilamida. Para detectar JNK2 minigene transcripciones, la PCR se realizó utilizando adelante primer exon 5 (5'-gatttgaagcctagcaacattg) y el primer BHG, y los productos fueron digeridos con EcoRV antes de la electroforesis en un 2% en geles de agarosa. Endógena JNK2 transcripciones fueron examinados por analogía, salvo que el exón 7 de primers (5'-cagttggctgaagtttcttc) en lugar de BHG se utiliza para la PCR.

RESULTADOS

Un informe anterior identificado ~ 400-U12 tipo intrones en el genoma humano (8]. Desde la base de datos continuamente aumentar las entradas, hemos intentado buscar humanos adicionales-U12 tipo intrones. Mediante el uso de una menor búsqueda de texto completo (véase Materiales y Métodos sección), nuestra colección de humanos-U12 tipo intrones, provisionalmente, se amplió a ~ 500. Las nuevas adiciones fueron principalmente los miembros de la conocida U12-intrón tipo de genes que contienen las familias. En este estudio, se aprovecharon de este grupo de U12-tipo intrones para buscar alternativas de empalme y de polimorfismos de nucleótido-U12 tipo intrones. También clasifican U12-intrón tipo de genes receptores de acuerdo a sus funciones celulares y en este documento discutir nuestras conclusiones.

Splicing alternativo con un U2-U12 híbrido intrón

El JNK familia de genes en vertebrados contiene un U2-U12 intrón híbrido que posee la U12 de tipo 5'SS y U2-tipo extremo 3 'de secuencias (Figura 1 A). Este intrón no puede ser adecuadamente empalmados, pero, junto con su U2-aguas arriba o aguas abajo tipo U12-intrones tipo, puede desempeñar un papel en la selección mutuamente excluyentes del exón 6 (12, 13]. Esta alternativa de empalme de control genera ARNm isoformas, algunas de las cuales exhiben la especificidad tisular. Por ejemplo, el exón 6 bis que contienen JNK2/SAPK α / MAKP9 isoformas son expresados preferentemente en las neuronas, mientras que la ubicua transcripciones contienen el exón 6 ter (15]. Esta observación indica la importancia biológica de la U2-U12 intrón mediada por el control de empalme.

En informes anteriores se ha demostrado que la expresión neuronal de exón 6 bis que contienen JNK2 isoformas es probable que sea impulsado por las neuronas específicas de las proteínas Nova (20, 21]. Sin embargo, hasta la fecha, las preguntas de por qué no neuronales JNK2 transcripciones incluyen preferentemente el exón 6 ter y cuál es el papel de los híbridos intrón desempeña en el exón alternativo de selección no se han investigado experimentalmente. Por lo tanto, se establece para hacer frente a estas cuestiones utilizando un sistema de minigene. En primer lugar, hemos examinado splicing alternativo de JNK2 en varias líneas celulares de mamíferos. RT-PCR se realizó con los primers específicos comunes a los exones 5 y 7. Dado que un sitio de restricción EcoRV reside en el exón 6 ter, pero no en 6 bis (Figura 1 A), la amplificación de PCR, ya sea que contengan fragmentos alternativa exón puede distinguirse de la digestión EcoRV (Figura 1 C, control). EcoRV resistentes a los productos se observaron en las células neuronales (Figura 1 C, P19 y N2A), pero apenas no detectada en las células neuronales-(HeLa y HEK 293). Este resultado se esperaba y se indica que el exón 6 bis se utiliza en las transcripciones JNK2 neuronal. Por otra parte, predomina la expresión de exón 6 ter que contienen isoformas en HeLa y células HEK 293 sugiere que el exón 6 ter selección es un empalme ruta por defecto en las células que carecen de empalme reguladores específicos como las proteínas Nova (20, 21].

En segundo lugar, establecimos un JNK2 minigene a examinar si el híbrido intrón exón 6 determina la selección. El minigene contenía un fragmento de genómica humana JNK2 de exón 5 a exón 8, en el que todos los intrones, excepto para los híbridos fueron uno internamente truncado (Figura 1 B). Expresión de la JNK2 minigene en células HEK 293 fue examinado por RT-PCR-EcoRV digestión. Según se observó con JNK2 endógeno (Figura 1 C), el minigene transcripciones que figura exclusivamente el exón 6 ter, pero no 6 bis en células HEK 293 (Figura 1 D, WT). Entonces cambié el exón 6a y 6b, cada uno de ellos junto con una parte de sus adyacentes intrones, en el minigene a examinar si el exón 6 bis por lo tanto, es activado en las células HEK 293 (Figura 1 B, Swap-E + I). Tenga en cuenta que los intrones entre los exones cambiado sigue siendo como un híbrido, es decir, el U12 de tipo 5'SS y U2-tipo 3'SS. Los resultados mostraron que el exón 6 ter dominado todavía más de 6 bis en el JNK2 transcripciones (Figura 1 D), lo que indica que la utilización del exón 6 en las células HEK 293 no está determinado por su posición, pero quizás por su secuencia. Para distinguir si el exón 6 ter o sus adyacentes intrón putativo secuencia proporciona señales para el exón elección, otro intercambio de minigene se construyó, en el que sólo la alternativa exón partes se intercambiaron (Figura 1 B,-Swap Eonly). Empalmes de esta transcripción minigene mostró uso exclusivo del exón 6 bis (Figura 1 D), lo que indica que en lugar de intrón exón secuencia contribuye a la alternativa de selección de exón, al menos en un país tercero, línea celular neuronal. Hemos tomado nota de que el polypyrimidine (Py) del tracto de la híbrido intrón es inusualmente largo y muestra un mayor grado de conservación a través de varias especies de vertebrados (Figura 1 E; conservación 67,6% vs 15-25% de conservación de varios otros JNK2 intrones). Por otra parte, en comparación con el intrón aguas arriba del exón 6 bis, el intrón híbrido tiene una mayor C / U contenido en el tracto Py (Figura 1 B, 26 C / Nosotros en el 3 '66 nucleótidos del intrón 5 vs 50 en el intrón híbrido ). Para examinar si el tracto Py del híbrido intrón contribuye a la utilización por defecto del exón 6 ter, hicimos varias supresión de los mutantes minigene (Figura 1 B). Figura 1 D muestra que una secuencia parcial Py aún conserva la plena actividad para el exón 6 ter inclusión (Δ Δ Py1 y Py2), mientras que la supresión de toda una Py tracto condujo un completo cambio de exón 6b a 6 bis (Δ Py). Sin embargo, un tracto Py heteróloga, derivados de un intrón de los adenovirus principales fines de transcripción, restaurado por completo el uso del exón 6 ter (Figura 1 D, AdPy). Por lo tanto, nuestros datos sugiere que un tracto Py, tal vez con una alta densidad de C / U residuos, es suficiente para activar el exón 6 ter utilización en JNK2.

En resumen, la Py el tracto de intrón híbrido proporciona una señal para la selección por omisión del exón 6 ter no en las células neuronales, tal vez de competir con el uso de la 3 'empalme sitio antes de que el exón 6 bis (Figura 1 F).

Efectos de SNPs en splicing alternativo de un tipo U12-intrón

Mientras tanto, también investigó las variaciones genéticas de tipo U12-intrones que podría activar splicing alternativo. Hemos seleccionado 50 ~ U12-intrón tipo que contienen los genes de ~ 500 miembros piscina para buscar su SNPs dentro o cerca del sitio de empalme-o-rama sitio secuencias de la U12 de tipo intrones. Además de LKB1 (10], nuestro análisis de SNPs identificados en la U12 de tipo intrón de otro gen, WDFY1. El WDFY1 gen codifica una proteína previamente uncharacterized que contengan WD40 repite y un dedo de zinc para Pi3 vinculante (16, 17]. Las dos variables nucleótidos detectado en la WDFY1 U12-intrón tipo se encuentran dentro de la 5'SS consenso y aguas arriba de la sucursal sitio. Polimorfismos de nucleótidos en el intrón secuencias consenso podría afectar directamente a pre-mRNA de empalme, lo que resulta en niveles de diferencial entre los individuos isoformas (22]. Desde U12-intrones tipo existen en un número de genes que codifican repetir WD-Pi3 proteínas y factores de señalización (8], por lo que pasó a caracterizar los efectos de la detectados U12-intrón tipo SNPs en el empalme de WDFY1 pre-mRNA.

U12-tipo intrones del mRNA en los factores de transformación

Se ha informado de que tipo-U12 intrones están presentes en varias grandes familias de genes debido principalmente a la amplificación de genes (8]. Concebible, los de tipo U12-intrón que contiene paralogs tienen similares funciones celulares; ejemplos incluyen voltaje dependientes de los canales de calcio subunidades, mitogen-activated proteínas quinasas (MAPK), RAP guanine nucleotide factores de cambio (RAPGEF) y la importina-β familia nuclear transportistas (8 Suplementario y el cuadro 1). Un informe anterior ha indicado que el tipo U12-intrones están excesivamente representados en los genes implicados en Ras-Raf vías de señalización (8]. También observó que el tipo U12-intrones prevalecen en algunos funcionalmente pero no genéticamente relacionados con los genes, como los que participan en la remodelación de la cromatina y control transcripcional (Cuadro 2) y los que participan en el metabolismo del mRNA (Tabla 1]. Algunos de estos ARNm procesamiento factores pueden participar directamente en pre-mRNA de empalme o incluso en splicing alternativo reglamento. Por otra parte, factores tales como transportin y AR proteínas quinasas implicadas en el metabolismo celular de empalme de reglamentación también poseen factores de tipo U12 intrones (8]. Dado que el empalme de tipo U12-intrones es un tipo de determinación de paso (24], expresión de estos genes podría ser controlada a nivel de pre-mRNA de empalme, lo que podría dar lugar posteriormente a una reglamentación mundial de splicing alternativo (Figura 3]. Si este es el caso, empalme de RNPC3 que codifica un componente esencial de empalme factor asociado con la U11/U12 snRNP (25] puede tener una retroalimentación sobre el control U12-intrón tipo de empalme; esta hipótesis aún no se ha investigado.

DISCUSIÓN

Para comprender mejor splicing alternativo de tipo U12-intrones, que examinó experimentalmente splicing alternativo eventos que fueron bien mediada por un U2-U12 híbrido intrón o inducidos por las mutaciones genéticas dentro de la U12-intrón tipo de elementos de consenso. Por otra parte, la presencia de U12-tipo intrones en un conjunto de genes factor de empalme nos lleva a la hipótesis de que su empalme, en particular la eliminación de la U12 de tipo intrón (s), podría tener algún impacto (s) en la expresión génica global.

Nuestro análisis hacia el papel de un U2-U12 híbrido intrón en el exón alternativo primera selección revela que el tracto Py de la persona humana JNK2 híbrido intrón es excepcionalmente largo y conservada y contiene un alto C / U contenido. Los experimentos de intercambio y el exón intrón truncamiento y la sustitución presentó pruebas que sugieren que el exón 6 ter inclusión, una vía frecuente en la no-células neuronales, principalmente a los atributos del tracto Py del híbrido intrón. En particular, el exón-sólo intercambio resultado podría casi excluye la posibilidad de que las secuencias de exonic tiene ningún efecto significativo en el exón selección, al menos, no en las células neuronales. Por otra parte, postula que el ubicuo activadores de empalme podría obligar a C / U ricos en elementos dentro del tracto Py del híbrido intrón, lo que el valor por defecto de empalme (Figura 1 F). Por otra parte, la sobreexpresión de proteínas neuronales Nova podría inducir el exón 6 bis inclusión vinculante a través de múltiples YCAY elementos (21]. Tenga en cuenta que los híbridos intrón también alberga YCAY elementos, y cinco de ellos son particularmente arraigadas en el tracto Py (Figura 1 F). Por lo tanto, también es posible que las proteínas Nova antagonizar la actividad de la CU-putativo elemento vinculante activadores vinculante a través de estos sitios YCAY, dando lugar a la supresión del exón 6 ter utilización en las células neuronales (Figura 1 F). Curiosamente, el tracto Py antes de exón 6 bis, aunque pobre en su contenido CU, no contiene los sitios de unión Nova. Tal vez, sin la competencia entre la Py y YCAY elementos, el exón 6 bis puede ser activado en las células neuronales. Tenga en cuenta que algunas de las JNK homólogos en pufferfish (fugu rubripes) y pez cebra (Danio rerio) contienen un solo exón 6 (o equivalente), de los cuales el río arriba y río abajo intrones son U2-y U12-tipo, respectivamente. Tal vez, el intrón híbrido surgido de la duplicación de un exón 6 ancestrales junto con una parte de sus adyacentes intrones, y su presencia, inevitablemente, llevó al uso exclusivo de una duplicación del exón 6.

Nucleótidos alteraciones en el empalme de sitio elementos de consenso-U12 tipo intrones puede activar críptico empalme de uso del sitio (9-11]. Nuestros resultados muestran que una mutación U12 5'SS en WDFY1 preferentemente aberrante 5'SSs inducida a través de la acción de la U2-tipo spliceosome (Figura 2 E). Por lo tanto, en consonancia con los informes anteriores (9-11], cuando el tipo U12-spliceosome no reconoce alterado 5'SS secuencia de un tipo U12-intrón, la abundancia de U2-tipo spliceosome puedan hacerse cargo de los 3'SS de este intrón a par con un críptico U2-tipo 5'SS. Aberrantes de empalme también se observó con una rama de sitio mutación; sin embargo, la utilización de 3'SSs aberrantes de la U12 de tipo spliceosome es particularmente activa en virtud de esta condición (Figura 2 E). Por lo tanto, el uso ineficaz de una variante rama de sitio secuencia podrá conducir la U12 de tipo spliceosome para buscar una rama aberrante sitio / 3'SS de empalme. Sin embargo, el U12 de tipo spliceosome funciones sólo cuando el 5'SS puede ser así reconocidos. Tal vez el auténtico 5'SS secuencia proporciona un sitio para U11 snRNP vinculante, lo que permite a sus socios U12 para localizar una respuesta adecuada, aunque críptica, secuencia de empalme. Cuando un tipo U12-intrón ha mutaciones, tanto en la rama y 5'SS sitio, el U2 de tipo spliceosome podría ocupar plenamente este intrón y la función de rendimiento aberrante empalme productos (Figura 2 E). Juntos, nuestros datos apoyan observaciones anteriores de que el U12 de tipo spliceosome tiene una secuencia más estrictos requisitos para la 5'SS que la sucursal sitio / 3'SS; en otras palabras, U12-intrón tipo de empalme puede tener lugar en variable 3'SS secuencias.

U12-tipo intrones, a pesar de que conserva más de tipo U2 intrones, las variaciones de nucleótidos en el sitio de empalme de los elementos [revisado en (5]]. En general, U12-intrón tipo de empalme tiene requisitos más rigurosos para intronic elementos y es probable que se limitación de velocidad en la reacción [revisado en (5]]. Por lo tanto, las variaciones de nucleótidos de polimorfismos y U12-intrones tipo podría afectar profundamente a empalme y cualquier combinación de cambios de nucleótidos podría exacerbar los defectos de empalme, según se desprende de nuestros datos (Figura 2]. Por otra parte, especular que el espectro de empalme defectos resultantes de U12 intrón polimorfismos poco difiere de la de U2 intrones de tipo aberrante porque U12-intrón tipo de empalme a menudo genera los productos mediante el uso de la críptica sitios de empalme y no a través de la omisión de exón (Figura 2 E) . En comparación con la omisión de exón, aberrante empalme de uso del sitio tiene una mayor probabilidad de generar productos con traducción prematuro codones de parada, lo que a su vez se traduce en baja regulación de la expresión génica (26]. Por lo tanto, la conclusión de que el empalme de U12-intrones tipo tiene un impacto sustancial sobre la expresión de genes específicos.

Aquí nos informe que tipo U12-intrones prevalecen en algunos genes que codifican para los factores de transformación de ARN; de especial interés es un conjunto de factores de empalme que participan en constitutiva y / o regulado de empalme. Teniendo en cuenta que U12-intrón tipo de empalme es la limitación de velocidad (24] y menos tolerante a las variaciones de nucleótidos en el empalme de sitio y la rama de sitio elementos (10 y este estudio), el rendimiento y la calidad / actividad de estos factores de procesamiento del ARN puede por lo tanto, ser controladas por empalme de su tipo U12-intrón (s). A través de las funciones de estas proteínas, U12-intrón tipo de empalme puede tener un impacto considerable en la expresión génica global a nivel de regulación splicing alternativo (Figura 3].

DATOS COMPLEMENTARIOS

Complementario se dispone de datos en línea NAR.

Damos las gracias a los árboles-Juen Chuang (Taipei), Tetsuro Hirose (Tokio) y Yi-Yu Tao (Rochester) para formular comentarios sobre el manuscrito y Tim C. Taylor para la edición del manuscrito. Esta labor fue apoyada por la Academia Sínica Premio de Investigación a W.-Y. Tarn. La financiación para pagar la publicación de acceso abierto cargo fue proporcionada por la Academia Sínica.

Conflicto de intereses declaración. Ninguno declarado.