Mediators of Inflammation, 2007; 2007: (más artículos en esta revista)

El efecto inhibitorio de Inflexinol sobre el óxido nítrico y de generación de iNOS Expresión a través de inhibición de NF-κ B de activación

Hindawi Publishing Corporation
Lee Jae Woong [1], Luna Soon Lee [2], Hun Kim Tae [1], Jeong Hwa Lee [1], Hong Seong Su [1], Young Hee Noh [3], Bang Yeon Hwang [1], Jai Seup Ro [1], Jin Tae Hong [1]

Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que la obra original esté debidamente citados.

Resumen

Inflexinol, una res-kaurane diterpenoid, se aisló de las hojas de Isodon excisus. Muchos diterpenoids aislados del género Isodon (Labiatae) han antitumorales y antiinflamatorios. Se investigaron los efectos antiinflamatorios de inflexinol en RAW 264,7 astrocitos y células. Como resultado, encontramos que inflexinol (1, 5, 10 μ M) suprimió la expresión inducible de óxido nítrico sintasa (iNOS) y la ciclooxigenasa-2 (COX-2), así como la producción de óxido nítrico (NO) en LPS estimulada RAW 264,7 astrocitos y células. De acuerdo con el efecto inhibitorio sobre la iNOS y COX-2 de expresión, también inhibió inflexinol transcripcional del ADN y vinculante actividad de NF-κ B, a través de la inhibición de la I κ B degradación, así como P50 y p65 en la translocación núcleo. Estos resultados sugieren que inflexinol iNOS e inhibe la COX-2 de expresión a través de la inhibición de NF-κ B de activación, lo que inhibe la generación de mediadores de la inflamación en las células RAW 264.7 y astrocitos, y puede ser útil para el tratamiento de enfermedades inflamatorias.

1. INTRODUCCIÓN

El óxido nítrico ( NO ), Los radicales libres producidos por la inducible NO sintasa ( iNOS ) Isoforma, es un componente esencial de la acogida inmune innata y la respuesta inflamatoria a una variedad de agentes patógenos [1]. Tiene diversas funciones fisiológicas y pueden también contribuir a procesos patológicos. Cuándo NO se sintetiza en grandes cantidades por células inflamatorias activadas, tiene propiedades citotóxicas y pueden estar involucrados en la patogénesis de agudos y crónicos de inflamación [2]. En particular, NO Se afirma que contribuyen a dañar la articulación del cartílago en la artritis reumatoide, a lesión de la mucosa en la enfermedad inflamatoria intestinal y la degeneración de las neuronas en las enfermedades neurodegenerativas, como scleroses múltiple, la enfermedad de Parkinson y la enfermedad de Alzheimer [3]. En la mayoría de enfermedades neurodegenerativas, una masiva muerte celular neuronal se produce como consecuencia de una respuesta inflamatoria descontrolada, donde activado astrocitos y microglia y sus agentes citotóxicos juegan un papel crucial patológico [4]. Células gliales que consta de astrocitos y microglia pueden producir citocinas, radicales de oxígeno reactivo, y NO en respuesta a isquémico, traumáticas, infecciosas y los insultos, dando lugar a una exageración de los procesos de la enfermedad [5].

Coinduction o la corregulación de la ciclooxigenasa-2 (COX-2) y iNOS Se ha demostrado en una serie de estudios de cultivo de células inflamatorias y los animales modelo [6, 7]. Tanto la COX-2 y iNOS son inducibles forma de enzimas hasta reguladas en respuesta a la inflamación desafío. En el proceso inflamatorio, la COX-2 se expresa en muchas células incluyendo fibroblastos y macrófagos, y produce las prostaglandinas que contribuyen al dolor y la hinchazón de la inflamación [8].

La expresión de estos genes inflamatorios, como iNOS y la COX-2 puede ser regulada por la activación del factor nuclear κ-B (NF-κ B). La investigación de la literatura revela que hay una NF-κ B consenso secuencia de ADN dentro de la COX-2 promotor [9], y dos NF-κ B secuencias de ADN dentro de consenso iNOS promotor [10] que son responsables de LPS inducido por NF-κ B ADN vinculante actividad. El más común de forma activa el NF-κ B familia es la p50/p65 o p52/p65 heterodimer. En la mayoría de tipos de células, inactiva NF-κ B complejos son secuestradas en el citoplasma a través de su interacción con noncovalent inhibidor de proteínas conocidas como I κ Bs. En respuesta a varios estímulos, entre ellos citocinas, virus, el estrés y la inducción de agentes, la latente frente al citoplasma de NF-κ B / I κ α complejo B es activado por fosforilación en residuos de serina conservado en la N-terminal porción de I κ B. Después de eso, activan NF-κ B translocates al núcleo y se une a sus afines ADN sitio de unión en el promotor o potenciador regiones de genes específicos [11]. NF-κ B es un importante factor de transcripción que juega un papel fundamental en varios aspectos de la salud humana, incluyendo el desarrollo de la inflamación y la inmunidad [12]. El dysregulation de NF-κ B se asocia con muchas enfermedades como la aterosclerosis, artritis, cáncer. Por lo tanto, una normativa adecuada y el control de NF-κ B actividad proporcionaría un posible enfoque para la gestión de NF-κ B relacionados con las enfermedades humanas [11].

Isodon excisus, llamado Ri Bang Oh Pul en Corea, pertenece al género Isodon y se distribuye en Corea y Japón. Los extractos se han utilizado en medicina horquilla en Corea para el tratamiento de un hematoma, inflamación y dolor. El género Isodon (también llamado Rabdosia) es una rica fuente de diterpenes, especialmente los altamente oxidados kaurene diterpenes. Ent-kaurene es el principal diterpene intermedias que participan en la biosíntesis de giberelinas, una amplia familia de hormonas vegetales con estructura isoprenoid que controlan diversas fisiológicas planta de funciones como el crecimiento, la germinación y floración [13]. Algunos kaurene ditrerpene compuestos se ha demostrado que no sólo muestran actividad citotóxica contra varias líneas celulares de cáncer, sino también actividad inhibitoria de la NF-κ B itinerario en macrófagos [14 - 16]. Por ejemplo, Linearol, un kaurene diterpene que la alteración inflamatoria de señalización mediante la inhibición de NF-κ B cinasa inducir a LPS-J774 inducida por los macrófagos [17]. Kamebakaurin, otro kaurane diterpene también inhibe el TNF-α inducida por NF-κ B de la activación directa covalentes modificación de la cisteína 62 en la P50 en MCF-7 células [18]. Por lo tanto, mucho interés recientemente se ha demostrado en los efectos biológicos de kaurene diterpenes.

En el presente estudio, se investigó la actividad antiinflamatoria de inflexinol y sus posibles mecanismos en cultivos de células RAW 264,7 y astrocitos. Inflexinol inhibido inducida por LPS NO producción, así como LPS-inducida de expresión iNOS y la COX-2 en células RAW 264,7 y astrocitos. El uso de gel de cambio de ensayo y NF-κ B luciferase ensayo, mostró que inflexinol inhibe la activación del factor transcripcional NF-κ B, un regulador central de iNOS y la respuesta inflamatoria del cuerpo. Estas nuestros datos demuestran que los inflexinol tiene efecto inhibitorio sobre NO producción a través de la inhibición de NF-κ B activación. Estos resultados sugieren que inflexinol puede ser utilizado para un agente antiinflamatorio.

2. MATERIAL Y MÉTODOS
2,1. Y productos químicos reactivos

Inflexinol (Figura 1] se aisló de Isodon excisus (Labiatae). La seca parte aérea de I. excisus (1,6 kg) se pulverizan y se extrajeron con MeOH (3 × 1,5 L) a temperatura ambiente (24 horas). El extracto se filtra y se concentra, en vacau y convenientemente diluido con agua, luego con la partición de n-hexano (3 × 1,5 L) y CH 2 Cl 2 (3 × 1,5 L), respectivamente. El CH 2 Cl 2 extracto (13,7 g) fue sometido a cromatografía en columna de gel de sílice (9 × 25 cm, 70-230 mesh) de elución con n-hexano-acetona (5: 1, 3: 1, 3: 2, acetona) que ofrezcan cinco fracciones ( IEC-1 ~ IEC-5). Porcentaje de IEC-3 fue sometido a cromatografía en columna flash en RP-18 (2 × 30 cm, 40-63 μ m) con elución CH 3 NC : H 2 O (30: 70) y semiprepatative HPLC (columna: YMC-ODC, de 20 × 150 mm) con elución CH 3 NC : H 2 O (23: 77) a la velocidad de flujo de 6,5 mL / min. La estructura de este compuesto se determinó como ent β -1, 3 α, β 6, 11 α-tetrahydroxykaur-16-ene-15-un-3 ,11-diacetato (inflexinol), por comparación de su físico-químicas y con los datos del espectro los de la literatura [19].

LPS se obtuvieron de Sigma Aldrich (St Louis, Mo, EE.UU.) Dulbecco modificada a medio Eagle (DMEM), suero fetal bovino, penicilina, estreptomicina y se compraron de Invitrogen (Carlsbad, Calif, EE.UU.).

2,2. RAW 264,7 cultivo celular

RAW 264,7 células se obtuvieron a partir de la American Type Culture Collection (Rockville, MD, EE.UU.). Estas células se mantuvieron en subconfluence en un 95% de aire, 5% CO 2 humidificado ambiente a 37 ° C. El medio utilizado para la rutina de subcultivos fue modificado Dulbecco's Eagle's Medium (DMEM, Invitrogen, Carlsbad, Calif, EE.UU.), completado con un 10% de suero fetal bovino (SFB), penicilina (100 unidades / mL) y estreptomicina (100 μ g / mL ). Las células se contó con un hemocitómetro y el número de células viables se determinó a través de trypan exclusión del colorante azul.

2,3. Astrocito cultura

El Sprague-Dawley, las ratas se mantuvieron en accodance con la política del Instituto Nacional de investigación toxicológica, que está de acuerdo con la Korea Food and Drug Administration de la directriz para el cuidado y el uso de animales de laboratorio. Sprague-Dawley, ratas 200-300 g de peso fueron alojados de menos de 12 horas luz / oscuridad ciclos, a 23 ° C, y 60 ± 5% de humedad. Todos los animales tienen libre acceso a los alimentos (Samyang Foods, Seúl, Corea del Sur) y el agua. Cerebral cortical células fueron aisladas de cerebro de rata neonatal (día 1) en PBS (0,1 mol). Tras el lavado con Dulbecco modificada a medio Eagle (DMEM), las células aisladas se incubaron durante 15 minutos en DMEM que contenga el 0,2% de tripsina. Las células fueron disociadas de trituration y chapada en polyethyleneimine recubiertos de plástico (5 × 10 5 mm cells/60 plato) con medio esencial mínimo de Eagle con sales de completarse con un 10% inactivado por calor suero fetal bovino, 2 mM L-glutamina, 1 mM piruvato , 20 mM KCl , 10 mM de bicarbonato de sodio, y 1 mM Hepes (pH 7.2). Después de 3 días en la cultura, el medio de cultivo fue reemplazado con DMEM que contenga 10% suero bovino fetal, y medio se cambió cada 3 días de la cultura. Las células fueron cultivadas por tiempo designado. Las células cultivadas que figuran <10% células neuronales.

2,4. Célula de ensayo de viabilidad

La citotoxicidad de inflexinol se evaluó usando la EAM-8 de ensayo (Dojindo Laboratories, Tokio, Japón). WST-8 [2 - (2-metoxi-4-nitrophenyl) -3 - (4-nitrophenyl) -5 - (2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolio, monosódico sal] se reduce de deshidrogenasas en las células para dar un de color amarillo-producto (formazan), que es soluble en el medio de cultivo. El importe de la formazan tinte generados por la actividad de deshidrogenasas en las células es directamente proporcional al número de células vivas. En resumen, 1 × 10 4 células por pocillo se chapada en placas de 96 pocillos, incubadas a 37 ° C durante 24 horas, y dado un nuevo cambio de medio de comunicación. Las células fueron incubadas con o sin LPS (1 μ g / mL) en la ausencia o presencia de varias concentraciones de inflexinol a 37 ° C por un período adicional de 24 horas. En ese momento, 10 μ l de la EAM-8 solución se añade a los pozos y se continuó la incubación de otro 1 hora. El color resultante fue ensayada a 450 nm utilizando un lector de microplacas absorbancia (Sunrise, Tecan, Suiza).

2,5. Nitrito de ensayo

Las células se cultivaron en placas de 96 pocillos y luego incubadas con o sin LPS (1 μ g / mL) en la ausencia o presencia de varias concentraciones de inflexinol durante 24 horas. La acumulación de nitritos en el sobrenadante fue evaluada por la reacción de Griess [20]. Cada 50 μ l de la cultura sobrenadante fue mezclado con un volumen igual de reactivo de Griess [0,1% N-(1-naphthyl)-etilendiamina, 1% sulfanilamide en el 5% de ácido fosfórico] y incubados a temperatura ambiente durante 10 minutos. La absorbancia a 540 nm se midió en un lector de microplacas absorbancia, y una serie de conocer las concentraciones de nitrito de sodio se utiliza como una norma.

2,6. Western blot

Las células fueron homogeneizados con la solución de extracción de proteínas (PRO-PREP, Intron Biotecnología, Corea del Sur), y sometido a lisis de 40 minutos de incubación en hielo. El lisado se centrifuga a 15 000 rpm durante 15 minutos. La misma cantidad de proteínas (40 μ g) fueron separadas en una SDS/10% de gel de poliacrilamida, y luego fue trasladado a un difluoride polivinilideno (PVDF) membrana (GE Water & Process tecnologías, de Trevose, Pa, EE.UU.). Blots fueron bloqueados por 2 horas a temperatura ambiente con un 5% (w / v) nonfat la leche en polvo en Tris-solución salina amortiguadora de Tween-20 [TBST: 10 mM Tris (pH 8,0) y 150 mM NaCl solución que contenga 0,05% de Tween-20]. Después de un corto lavado en TBST, la membrana se incubó a temperatura ambiente con anticuerpos específicos. Anticuerpos policlonales de conejo contra iNOS y la COX-2 (1: 1000) (Cayman Chemical, Ann Arbor, Mich, EE.UU.), y anticuerpos policlonales de conejo contra el p65 y yo α κ B (1: 500), y el anticuerpo monoclonal de ratón contra P50 (1: 500) ( Santa Cruz de Biotecnología Inc Santa Cruz, Calif, EE.UU.) se utilizaron en el estudio. La mancha se incuban con el conjugado correspondiente antirabbit o inmunoglobulina G de ratón-peroxidasa de rábano (Santa Cruz de Biotecnología Inc Santa Cruz, Calif, EE.UU.). Proteínas inmunorreactivas se detectaron con la ECL Western Blot sistema de detección.

2,7. Gel electromobility cambio de ensayo

Gel cambio ensayos se realizaron según las recomendaciones del fabricante (Promega, Madison, Wisconsin, EE.UU.). En resumen, 5 × 10 6 células se lavan dos veces con 1 × PBS, seguido por la adición de 1 ml de PBS, y las células se raspó en un tubo Eppendorf fría. Las células fueron abajo a hilar 13 000 rpm durante 5 minutos, y la consiguiente sobrenadante fue removido. Las células se suspendieron en 400 μ l de una solución que contiene 10 mM HEPES, pH 7,9, 1,5 mM MgCl 2 , 10 mM KCl , 0,5 mM dithiothreitol, 0,2 mM phenylmethylsulfonyl flúor; vigorosamente vortexed; permitido a incubar en hielo durante 10 minutos y se centrifuga a 12 000 rpm durante 6 minutos. Los núcleos se pildoradas resuspendido en solución C (solución A + 420 mM NaCl , El 20% de glicerol) y permitió a incubar en hielo durante 20 minutos. Las células fueron centrifugadas a 15 000 rpm durante 15 minutos, y la consiguiente nuclear extraer el sobrenadante se recogió en un tubo Eppendorf refrigerada. Consenso de oligonucleótidos fueron final marcado utilizando T4 polinucleótido quinasa y - 32 P] ATP durante 10 minutos a 37 ° C. Gel cambio reacciones fueron reunidos y les permite incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos seguidos por la adición de 1 μ l (50 000-200 000 cpm) de 32 P-etiquetados fin de oligonucleótidos y otros 20 minutos de incubación a temperatura ambiente. Posteriormente 1 μ l de gel de tampón de carga se añade a cada reacción y la cargaron en un 6% nondenaturing electroforesis en gel y hasta el tinte es de cuatro quintas partes de la manera en el gel. El gel se seca a 80 ° C durante 1 hora y expuestos a la película de la noche a la mañana a 70 ° C.

2,8. Transfección y asssy de NF-κ B luciferase actividad

RAW 264,7 astrocitos y células fueron chapados a una densidad de 1 × 10 5 células por 24 y placa. Después de 24 horas de crecimiento a 90% confluencia, las células fueron transfectadas con PNF-κ B-Luc plásmido (5 × NF-κ B; Stratagene, Calif, EE.UU.), utilizando una mezcla de plásmido y lipofectAMINE PLUS en OPTI-MEN de acuerdo con fabricación de especificación (Invitrogen, Carlsbad, Calif, EE.UU.). Luciferase actividad se midió utilizando el kit de ensayo luciferase (Promega, Madison, Wisconsin, EE.UU.), con arreglo a las instrucciones del fabricante (WinGlow, Bad Wildbad, Alemania).

2,9. Evaluación estadística

Los datos representan la media ± (SE) de tres experimentos independientes realizados por triplicado. El análisis estadístico se realizó mediante ANOVA de un factor, seguido de una prueba de Dunnett como comparación post hoc. Las diferencias se consideraron significativas a P <.05.

3. RESULTADOS
3,1. Efecto de inflexinol sobre la viabilidad celular en las células RAW 264,7 y astrocitos

Después de RAW 264,7 células fueron incubadas con inflexinol en ausencia de LPS, inflexinol aumentó ligeramente la viabilidad celular a concentraciones más bajas (1, 5 μ m) y mostró leve reducción (<20%) de la viabilidad celular en mayor concentración (10 μ M) utilizados (Figura 2 (a)]. Cuando RAW 264,7 células fueron incubadas con inflexinol en presencia de LPS, LPS aumentó notablemente la viabilidad celular. Aunque leve reducción de la viabilidad celular (<20%) se mostraron de 10 μ M de inflexinol como caso anterior, se considera que el efecto inhibitorio de los mediadores de la inflamación de infleixnol no está relacionada con el efecto citotóxico (Figura 2 (b)].

Por otra parte, inflexinol (con o sin LPS) no sólo no disminuyó la viabilidad celular en las diversas concentraciones (1, 5, 10 μ M) utilizadas en astrocitos si inflexinol fue tratado con o sin LPS (Figuras 2 (c] y 2 (d] ).

3,2. Efecto de inflexinol en LPS inducido por la producción de NO y iNOS y COX-2 expresión en RAW 264,7 astrocitos y células

Hemos examinado el efecto inhibidor de inflexinol en NO producción de 264,7 RAW astrocitos y células inducidas por LPS (1 μ g / ml). Para evaluar el efecto de inflexinol en NO en la producción inducida por LPS-RAW 264,7 astrocitos y células, la acumulación de nitrito fue examinado por el ensayo de Griess. Después de co-tratamiento con LPS y inflexinol (1, 5, 10 μ M) por 24 horas, inducida por LPS concentraciones de nitritos en el medio se redujeron notablemente en una operación de concentración dependen de los productos básicos. En RAW 264,7 células (Figura 3 (a)] y astrocitos (Figura 3 (b)], los valores de CI 50 de inflexinol en la inhibición inducida por LPS NO la producción se μ M 3,43 y 2,66 μ M, respectivamente.

Para investigar si inhibe la inflexinol NO producción a través de la inhibición de la expresión de genes correspondientes, se determinó iNOS expresión a través de Western blot. También determina la COX-2 ya que la expresión iNOS puede ser modulada por la COX-2. Como se muestra en las figuras 3 (c] y 3 (d], las células expresó muy bajos niveles de iNOS y la COX-2 en una proteína unstimulated condición. Sin embargo, iNOS y la COX-2 expresión proteica fue notablemente aumentado en respuesta a LPS (1 μ g / ml) después de 24 horas. El tratamiento con inflexinol (1, 5, 10 μ M) causado dependiente de la concentración disminuye en LPS-inducida iNOS expresión en las células RAW 264,7 (Figura 3 (c)] y astrocitos (Figura 3 (d)]. Este resultado es coherente con el perfil del efecto inhibitorio de inflexinol en NO producción. Un similar efecto inhibitorio de inflexinol en el LPS-inducida por la COX-2 se encontró expresión (Figuras 3 (c] y 3 (d)].

3,3. Efecto de inflexinol a NF-κ B luciferase actividad

NF-κ B, controla la expresión de enzimas incluidas iNOS y la COX-2 cuyos productos contribuyen a la patogénesis del proceso inflamatorio [20]. Para investigar si inflexinol es capaz de atenuar LPS-inducida por NF-κ B mediada por la actividad promotora, se utilizó un reportero luciferase genes expresados bajo el control de cinco κ B cis-actuando elementos. RAW 264,7 astrocitos y células fueron transfectadas transitoriamente con la NF-κ B-dependientes luciferase reportero construir de acuerdo a la especificación de fabricación (Invitrogen) y, a continuación, las células tratadas con LPS (1 μ g / mL) o cotreated con LPS y inflexinol durante 8 horas. Tratamiento de RAW 264,7 células (Figura 4 (a)] y astrocitos (Figura 4 (b)] con inflexinol dado lugar a un dependiente de la dosis de represión luciferase actividad inducida por LPS. En RAW 264,7 astrocitos y células, los valores de CI 50 de inflexinol en la inhibición inducida por LPS-luciferase actividad se μ M 2,77 y 3,88 μ M, respectivamente. Estas dosis que inhiben la NF-κ B luciferase actividad fueron similares a las dosis que inhiben NO producción.

3,4. Efecto de inflexinol a NF-κ B ADN vinculante actividad

Debido a la activación de NF-κ B es fundamental para la inducción de COX-2 y iNOS LPS o por otras citoquinas inflamatorias, a fin de determinar si podría suprimir inflexinol NF-κ B en la activación LPS-activated RAW 264,7 astrocitos y células. Para investigar si inflexinol también puede inhibir la NF-κ B activación, RAW 264,7 astrocitos y células se cotreated con LPS y inflexinol durante 60 minutos y 90 minutos, respectivamente, lo que es el momento de activar NF-κ B al máximo de su tratamiento LPS ( los datos no se muestra). Extractos nucleares de células cotreated se prepararon y ensayaron NF-κ B ADN vinculante por la AESM. En RAW 264,7 células (Figura 4 (c)] y astrocitos (Figura 4 (d)], LPS inducido por una fuerte NF-κ B vinculante actividad, que fue marcadamente inhibida por cotreatment con inflexinol en una dosis-dependiente.

3,5. Efecto de inflexinol en LPS inducido por p50/p65 translocación y la degradación de I κ B

Se ha demostrado que el LPS activa NF-κ B, factor de transcripción que da lugar a la inducción de la expresión de muchos genes principios de inmediato [21]. Para aclarar el mecanismo inhibitorio de la acción de inflexinol para LPS-inducida por NF-κ B, la translocación de P50 y p65, así como yo κ B α degradación se examinaron. El tratamiento con LPS aumento de la translocación nuclear de P50 y p65. En presencia de inflexinol, translocación nuclear de P50 y p65 se inhibe en forma dosis-dependiente en modo RAW 264,7 astrocitos y células. Por otra parte, inflexinol inhibido el LPS de degradación de I α κ B (Figuras 5 (a] y 5 (b)]. Estos resultados indican que inflexinol puede inhibir el LPS-inducida por la activación de NF-κ B, a través de una inhibición de la I κ B α degradación, así como una translocación de P50 y p65 en las armas nucleares, y este efecto puede tener como resultado la inhibición de la LPS inducida NO producción, así como iNOS y la COX-2 de expresión.

4. DISCUSIÓN

Procesos inflamatorios juegan un papel crítico en la patogénesis de muchas enfermedades humanas. Macrófagos sobreproducción de mediadores inflamatorios como citocinas y NO ha sido implicado en enfermedades inflamatorias como la artritis reumatoide, el shock séptico, el paludismo cerebral, diabetes y trastornos autoinmunes [22]. Astrocitos desempeñan un papel fundamental en la regulación de los aspectos de la inflamación en el sistema nervioso central. Varios enzimas, como la iNOS o la COX-2, junto con los diferentes mediadores inflamatorios, como la de radicales libres NO o citocinas proinflamatorias, han sido propuestos para participar en el daño celular asociado con neuroinflammation [23]. En este estudio, se investigó el efecto inhibitorio de inflexinol en LPS-inducida NO la producción y de expresión iNOS , La COX-2 en células RAW 264,7 y astrocitos. Inflexinol (1, 5, 10 μ M), inhibió que LPS-inducida NO producción en un dependiente de la dosis. Inflexinol mucho más inhibida inducida por LPS NO producción en RAW 264,7 astrocitos y células con IC 50 valores de 3,43 μ M y 2,66 μ M, respectivamente. Estos efectos inhibitorios pueden no estar relacionados con sus efectos citotóxicos, ya que no efectos en la viabilidad celular se observaron en la concentración de hasta 10 μ M en células RAW 264.7 y astrocitos. Comparación con IC 50 valor de indometacina (53,8 μ m) y lornoxicam (65 μ M) se conoce como AINES en LPS-estimulado RAW 264,7 células indica que ha inflexinol superior a efectos de la inhibición NO producción [24, 25].

Este efecto inhibidor de NO la producción podría estar relacionada con la expresión de genes de iNOS desde inflexinol inhibido iNOS proteínas en las células RAW 264,7 y astrocitos. Inflexinol también inhibe LPS-inducida por la COX-2 de expresión. Estos resultados mostraron que pueda interferir inflexinol LPS-inducida por la señalización que implique la producción de moléculas proinflamatorias. Sin embargo, nuestros datos muestran que la expresión de la COX-2 resultó ser menos sensible que la de iNOS a la inflexinol. Este podría ser responsable de la mayor sensibilidad de iNOS la transcripción de genes hacia la inflexinol en comparación con la de la COX-2. De hecho, estructuralmente diferentes diterpenoids muestra diferencial de la inhibición iNOS y la COX-2 de expresión a pesar de que el ADN vinculante actividad de NF-κ B es similar [26]. Desde inducida por LPS iNOS y la COX-2 es fundamentalmente expresión regulada por NF-κ B, hemos examinado el efecto de LPS en inflexinol inducida por la activación de NF-κ B, utilizando un NF-κ B reportero sistema, así como de ADN vinculante actividad utilizando la AESM. De acuerdo con el efecto inhibitorio sobre iNOS y la COX-2 de expresión, inflexinol disminuyó NF-κ B actividad transcripcional en células RAW 264,7 y astrocito con IC 50 valores de 2,77 μ M y 3,88 μ M, respctively. Inflexinol también inhibe NF-κ B-ADN específico vinculante actividad dosis dependiente. En el nivel de genes, la expresión de iNOS es en gran medida regulada por la activación transcripcional. El promotor de la iNOS gen contiene dos grandes regiones discretas sinérgicamente funcionamiento de unión de factores de transcripción: una para NF-κ B, que es principalmente activado por LPS [21]. Hay también una NF-κ B consenso secuencia de ADN dentro de la COX-2 promotor. Por lo tanto, la inhibición de NF-κ B activación podría contribuir al efecto inhibitorio de inflexinol en iNOS y la COX-2 de expresión.

Varios estudios han demostrado que los agentes antiinflamatorios inhiben la activación de NF-κ B, a través de la prevención de I κ B degradación. I κ B α se une específicamente y máscaras de la translocación nuclear señales de P50 y p65, lo que impide la translocación nuclear del NF-κ B heterodimer. Hehner et al. han mostrado que sesquiterpene lactonas impedido la degradación de I κ B α y β κ B de diversos estímulos y, por tanto, interfiere con un paso en la cascada de señalización que conduzcan a la activación de NF-κ B [27]. Lee et al. también han demostrado que la prevención de la I κ B degradación de 2'-hydroxycinnamaldehyde contribuido a la inactivación de NF-κ B (P50) en antiinflamatorio reacción en RAW 264,7 células [28], así como TNF-α-tratadas de cáncer de colon muerte celular [29 ].

La forma en que inflexinol pueden interferir con NF-κ B activación no está claro. Sin embargo, cabe destacar que contiene una inflexinol α-methylenecyclopentanone fracción común como un grupo funcional que se conoce a reaccionar con nucleophiles, especialmente cystein sulfhydryl grupos de proteínas, por un Michael Además de tipo. A C-20-nonoxygenated-ENT-kaurane diterpenoid (kamebakaurin, KA), aislado de Isodon japonicus, se sugirió que interactúan con el ADN de cisteína vinculante dominio de la subunidad P50 de NF-κ B [15]. Recientemente, KA resultó ser capaz de interactuar tanto con P50 y p65 subunidades de NF-κ B [26]. Hehner et al. también demostró que sesquiterpene lactonas interferido con la activación de NF-κ B de impedir una degradación de I κ B α y β κ B, pero que no posea ni la lactona exomethylene o el grupo en la posición α-lactona a la función no está representada efecto inhibitorio en la vía conducente a la activación de NF-κ B [27]. Del mismo modo, la exomethylene grupo de inflexinol puede ser esencial para la modificación covalente a través de la interacción con cisteína como por encima de los compuestos. Por otra parte, los datos presentados en este documento muestran que inhibe significativamente inflexinol NF-κ B activación de la reducción de la degradación de I κ B. Kwok et al. han informado de que exocylic de metileno sesquiterpene lactona parthenolide es necesario para in vivo e in vitro la actividad antiinflamatoria y la modificación de la cisteína 179 de IKK β se ha propuesto para mediar los efectos patológicos de arsenite y parthenolide [30]. Por lo tanto, nuestros datos sugieren una posibilidad de que inflexinol inhibir la subida de proteínas I κ B como IKK o proteasoma 26s. Esta cuestión está siendo actualmente investigado.

Sobre la base de los resultados actuales y los de otros informes, proponemos que inflxinol inhibir la expresión de iNOS , La COX-2, y NO producción de la inhibición de NF-κ B ADN vinculante y actividad transcripcional de activación a través de la prevención de I κ B degradación, y sugieren que inflexinol puede ser útil como un agente antiinflamatorio.

Esta labor fue apoyada por los Centros de Investigación Regional del Programa del Ministerio de Educación y Desarrollo de Recursos Humanos en Corea del Sur.