Immunity & Ageing, 2007; 4: 3-3 (más artículos en esta revista)

Compartimiento de células NK en pacientes con enfermedad coronaria

BioMed Central
HAK Łukasz (lhak@amg.gda.pl) [1], Jolanta Myśliwska (jolmys@amg.gda.pl) [1], Joanna Więckiewicz (jwiec@amg.gda.pl) [1], Krzysztof Szyndler (szyndler @ wp.pl) [2], Piotr Trzonkowski (ptrzon@amg.gda.pl) [1], Janusz Siebert (kmr@amg.gda.pl) [3], Andrzej Myśliwski (anmys@amg.gda.pl) [ 1]
[1] Departamento de Histología e Inmunología, Facultad de Medicina de la Universidad de Gdansk, Gdansk, Polonia
[2] Académica Clínica de cardiocirugía, la Universidad de Medicina de Gdansk, Gdansk, Polonia
[3] Departamento de Medicina de Familia, Universidad de Medicina de Gdansk, Gdansk, Polonia

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Resumen
Fondo

Virales y las infecciones bacterianas se han considerado como un factor de riesgo para la cardiopatía coronaria (CHD). Células NK, como primera línea de defensa contra esas infecciones, pueden desempeñar un papel en el desarrollo de las enfermedades del corazón. Por lo tanto, el principal objetivo de nuestro estudio fue determinar compartimiento de células NK en pacientes con cardiopatía coronaria en la arteria coronaria de by-pass injerto.

Resultados

Noventa tres pacientes con cardiopatía coronaria se incluyeron en el estudio; el grupo control consistió en 49 voluntarios sanos. En comparación con los controles, los pacientes tenían enfermedades del corazón menor actividad citotóxica NK. CHD grupo también había una disminución en número absoluto y porcentaje del total de células NK y CD3-CD56dim citotóxica NK subconjunto. Además, se observó tendencia a la baja el porcentaje de CD3-CD56bright subconjunto de regulación de Nagorno-Karabaj y CD3-CD56 + IFN-γ + células en pacientes con cardiopatía coronaria.

Conclusión

Estos datos indican que las enfermedades del corazón se asocia con un deterioro de las células NK compartimiento.

Fondo

NK son un componente inespecífico de la respuesta inmune que participan en la defensa contra los virus y las infecciones bacterianas [1]. Es bien demostrado que estas células juegan un importante papel regulador en la respuesta inmune innata. Sobre la base de la superficie celular CD56 densidad de los receptores, las células NK humanos se pueden dividir en dos subpoblaciones, es decir, CD56dim y CD56bright células NK [2]. El CD56dim células comprenden alrededor del 90% de CD56 positivas las células NK [3]. Que ejercen el efecto citotóxico a través de perforins y granzymes [1]. Estas células también poseen la capacidad de formar conjugados con las células diana [4]. En contraste, las células CD56bright están involucrados en la regulación de la respuesta inmune innata a través de la secreción de una variedad de citocinas, como IFN-γ, TNF-β, IL-10, IL-13 y GM-CSF [5, 6]. Cuando quiescent, CD56bright las células NK son menos citotóxicos que CD56dim células NK.

Enfermedad coronaria (CHD) ha sido considerada como una enfermedad de etiología que podría ser por lo menos en parte relacionado con infecciones crónicas y prolongado estado inflamatorio [7, 8]. Aparte de los clásicos factores de riesgo tales como trastornos metabólicos, hipertensión, la diabetes y la edad, las infecciones y también la carga de patógenos han sido considerados como un posible factor de riesgo para las enfermedades del corazón. Los principales sospechosos vinculados a la enfermedad vascular son objeto de violaciones flagrantes de organismos como el citomegalovirus (CMV) y Chlamydia pneumoniae. ADN de estos patógenos se encontró a principios de lesiones ateroscleróticas [9, 10]. También modelos animales confirmado una asociación entre las infecciones y las enfermedades vasculares. Se encontró que las infecciones por CMV, así como con Chlamydia pneumoniae, acelerar el desarrollo de la aterosclerosis en ApoE-/ - ratones [11, 12].

Es evidente que, como las infecciones deterioran el curso de las enfermedades del corazón y las células NK son la primera línea de defensa contra las infecciones, podría haber un vínculo entre el desarrollo de las enfermedades del corazón y las células NK. En 1997, Ogata y compañeros de trabajo mostró que la baja actividad citotóxica NK en las personas de edad se correlaciona con una historia de infecciones graves o la muerte debida a infecciones [13]. Por otra parte, la disminución de las células NK la actividad citotóxica se relaciona con la susceptibilidad a las enfermedades infecciosas comunes en las personas de edad [14]. También se postula que el número de células NK se correlaciona positivamente con la edad, que se considera como una posible indemnización por disminución de la citotoxicidad de células NK durante el envejecimiento [15]. Disminución de las células NK respuesta citotóxica con la edad se observó por Mariani y colegas [16]. Sin embargo, cuando muy saludables las personas mayores fueron seleccionados la disminución de la actividad citotóxica no se ha encontrado [17]. De este modo, se puede concluir que los llamados "envejecimiento sano" está conectado con un mayor número de células NK y conservas de células NK respuesta citotóxica.

También vale la pena mencionar que en los ancianos, las células NK constituyen el principal mecanismo de defensa antiviral [18]. Por otra parte, la actividad citotóxica de estas células puede ser modulada por las infecciones durante las dos bacterias y los virus [19 - 21]. También la inflamación afecta a funciones de la célula NK; nuestros estudios anteriores mostraron que la alta concentración de citoquinas proinflamatorias se correlaciona con una baja actividad citotóxica NK [22, 23]. Similares datos se obtuvieron en la sepsis [24].

NK actividad es un componente clave de la defensa inmune contra la obliga, intracelular de bacterias y virus patógenos. Su baja actividad puede dar lugar al desarrollo de infecciones persistentes y sus consecuencias como una mayor riesgo de cardiopatía coronaria. Por no hablar de que la inflamación relacionada con las enfermedades del corazón pueden seguir disminución de células NK funciones. Por lo tanto, encaminados a caracterizar las células NK compartimento, es decir, CD56dim/bright número de células NK y su actividad citotóxica en pacientes de larga duración las enfermedades del corazón. Se encontró que la cardiopatía coronaria pacientes tuvieron menor actividad citotóxica NK, disminución del número absoluto y porcentaje del total de las células NK, así como el CD3-CD56dim citotóxica NK subconjunto y, CD3-CD56bright subconjunto de regulación de Nagorno-Karabaj.

Resultados
Datos clínicos básicos

Como se muestra en la Tabla 1, no hubo diferencias en edad y sexo entre la CHD y los grupos de control. No es de extrañar que el porcentaje de personas con una historia de tabaquismo, así como las personas que sufren de hipertensión arterial fue mayor en el grupo con enfermedad coronaria. Además, los grupos diferían en un espectro de tratamiento médico. Ninguna de las drogas influyó en forma significativa los parámetros examinados actividad de NK.

Actividad de las células NK

Nuestro primer enfoque, cuyo objetivo es especificar la actividad de las células asesinas naturales en los grupos. Se estimó que por tanto, las células NK citotóxica de ensayo y de medición de IFN-γ intracelular de la producción en CD3-CD56 + células. Hubo diferencias significativas en la actividad citotóxica NK intracelular y la producción de IFN-γ entre los pacientes y el grupo control (Tabla 2]. Las células natural killer grupo de enfermedades del corazón son menos citotóxicos que los de individuos sanos. También se observó la tendencia a la baja de la producción intracelular de IFN-γ por las células NK en las enfermedades del corazón (p = 0,07).

Circulante subconjuntos de células NK

A continuación se formuló una pregunta, si la menor actividad de NK en los pacientes con enfermedad coronaria se pueden conectar con los cambios en la composición del compartimiento de Nagorno-Karabaj. Para resolver este problema hemos estudiado los cambios en el número total de células NK, el CD3-CD56bright regulador células NK y los CD3-CD56dim células NK citotóxica por citometría de flujo. El porcentaje de células NK circulantes (CD3-CD56 +), medido en los linfocitos puerta, fue menor en pacientes con cardiopatía coronaria que en el grupo control (p = 0,00003). Del mismo modo, el CD3-CD56dim células fueron menos frecuentes en las enfermedades del corazón (p = 0,00005, Fig. 1]. Se encontró también una tendencia hacia la diferencia en el porcentaje de CD3-CD56bright células (p = 0,06, Fig. 1]. Estos resultados fueron confirmados por el análisis del número total de células NK circulantes (Cuadro 3]. Los valores absolutos de CD3-CD56 + CD3-y CD56dim células fueron inferiores en grupo las enfermedades del corazón en comparación con el grupo control. Por otra parte, el número absoluto de leucocitos fue mayor en las enfermedades del corazón grupo que en el grupo control.

El tabaquismo, el tratamiento médico y las células NK

No hubo efecto significativo del consumo de tabaco y el tratamiento médico en subconjuntos de células NK y las funciones (p> 0,1).

Discusión

Los resultados de nuestro documento reveló que los pacientes con enfermedad coronaria se caracterizan por la disminución de la actividad citotóxica NK en comparación con emparejados por edad el grupo control sano. CHD pacientes tuvieron significativamente menor número absoluto y porcentaje del total de las células NK, así como las principales citotóxica NK subconjunto, es decir, CD56dim células. El porcentaje de reglamentación NK subconjunto CD56bright también fue menor en pacientes con cardiopatía coronaria, sin embargo, la diferencia no alcanzó significación estadística. Producción intracelular de IFN-γ en CD3-CD56 + células NK, lo que puede ser considerado como un marcador de actividad NK, fue ligeramente inferior en los pacientes enfermedades del corazón.

Nuestros resultados se complementan y amplió estudios previos de Bruunsgaard [25] y Jonasson [26] que han documentado las células NK deterioro en las enfermedades cardiovasculares. Bruunsgaard reveló que los pacientes con bajos tobillo-branquial índice de presión arterial, lo que indica una solución pronta, sin síntomas de la aterosclerosis etapa, se caracterizan por una baja citotoxicidad por células NK. Sin embargo, el total de células NK la actividad citotóxica en Bruunsgaard del estudio fue similar al grupo control en los pacientes tenían enfermedades del corazón ligeramente mayor número de células NK. Es digno de destacar que los datos del Bruunsgaard ilustra los cambios en las células NK en un compartimiento de principios de la aterosclerosis y no totalmente sintomático en las enfermedades del corazón, lo que puede explicar la discrepancia entre este informe y nuestro estudio.

Estudio de Jonasson [26] mostró que los pacientes con angina estable se caracterizan por una disminución en las células NK la actividad citotóxica. Nuestro trabajo confirma esta conclusión y proporcionó algunos datos novedosos. En los estudios sobre la Jonasson sólo el porcentaje del total de CD3-CD56 + células NK y su CD3-CD56dim subconjunto fueron las enfermedades del corazón disminuyó en los pacientes. En contraste con nuestro estudio, no encontró una diferencia en el número absoluto de las células. Se encontró una tendencia a menor porcentaje de los CD3-CD56bright células en pacientes con cardiopatía coronaria en comparación a controles sanos. Por otra parte, también reveló que las células NK de pacientes con enfermedades cardíacas producidas menos IFN-γ lo que puede explicar su menor actividad citotóxica. Sin embargo hay que recordar que estos datos se encuentra en el borde de importancia.

La razón por la cual nuestro estudio es novedoso viene del hecho de que nuestro grupo experimental es distinto de los anteriormente analizados. Bruunsgaard [25] analizaron los pacientes con aterosclerosis temprana. Jonasson estudiado más avanzado, pero los pacientes son menores de nuestra cohorte y que todavía no llegó a la etapa que requiere cirugía CABG. Parece que los cambios en las células NK compartimiento están avanzando con el desarrollo de las enfermedades del corazón. Es por eso que en los anteriores estudios, que examinó grupo de pacientes con etapas tempranas de las enfermedades del corazón, el deterioro de las células NK compartimento no fue tan amplia. Por lo tanto, la medición de la condición de las células NK puede considerarse como un indicador de riesgo para la salud en pacientes con trastornos cardiovasculares.

A la luz de la literatura actual la pérdida de funciones de la célula NK puede tener un impacto importante en los pacientes con cardiopatía coronaria. La actividad citotóxica de las células asesinas naturales pueden considerarse como un predictor de larga vida y un marcador de estado inmune. Centerians NK tienen mayores valores en relación con las personas de mediana edad y similar a los jóvenes [18]. Junto con la función citotóxica también el CD3-CD56dim células, el subgrupo con alta propiedades citotóxicas, resultó ser ampliada a las personas de edad [27]. El éxito de envejecimiento está relacionado con una alta actividad citotóxica NK y aumento del número total de las NK compartimiento. Los resultados de nuestro estudio indican que en pacientes con cardiopatía coronaria avanzada la remodelación del compartimiento de las células NK es desfavorable. Esto indica que las enfermedades del corazón son pacientes afectados por la enfermedad vascular coronaria y la deficiencia de la actividad de células NK. La búsqueda de culpables de la inmunosupresión en pacientes con cardiopatía coronaria, el papel de los agentes patógenos ha de tenerse en cuenta. Recientemente, las infecciones han sido considerados como un posible factor de riesgo para enfermedad coronaria. Los principales sospechosos vinculados a la enfermedad vascular son el virus herpes, citomegalovirus (CMV) y bacterias gram negativas. Estos agentes patógenos Mayo deprimir el sistema inmunológico de diferentes maneras. En la fase temprana de la infección por citomegalovirus provoca la liberación de IL-10 [28]. Del mismo modo, la producción de IL-10 de monocitos es elevada durante la infección por Chlamydia pneumoniae [29]. IL-10 es una citoquina que influye directamente en las células NK amortigua su actividad citotóxica [30]. IL-10 es contraria a la IL-2 secreción, lo que se traduce en disminución de la función de la célula NK [31, 32]. Por otra parte, un aumento de los CD8 + CD28-CD57 + células T se observó durante el CMV a largo plazo la persistencia de la infección [33]. La expansión de estas células se informó también de las enfermedades del corazón en los pacientes, y el número de estas células correlacionó positivamente con anticuerpos anti-CMV IgG títulos [34]. El CD8 + CD28-CD57 + células T se consideran principalmente CMV específica y la expansión de estas células no es neutral para las células NK. En 1991 Autran y compañeros de trabajo puso de manifiesto que la CD8 + CD57 + pueden tener efecto supresor sobre las células NK funciones [35]. Estos datos indican que la participación activa de la infección con patógenos específicos pueden afectar a las células NK funciones. Viceversa, la baja actividad NK puede ser una de las posibles puertas de propagación de la infección, y esto puede ser una forma de profundización de la deficiencia de células NK. En total, se crea un circuito de retroalimentación positiva que conduzcan a un progreso acelerado de las enfermedades asociadas con infecciones crónicas. Este mecanismo tiene un significado principal en el envejecimiento. Ogata y sus colegas sugiere que los estudios de baja actividad de las células NK es un marcador de infecciones pasado y también un factor de predicción de la supervivencia a corto debido a las infecciones en las personas de edad [13, 14]. Así, bajo la actividad citotóxica de las células NK es un factor, que conecta el estado de salud de los pacientes con cardiopatía isquémica su susceptibilidad a las infecciones.

La tendencia hacia la disminución del nivel de CD3-CD56bright células encontradas en nuestro estudio concuerda con la hipótesis de que las células NK funciones deteriorándose debido a la inflamación crónica. Se ha sugerido que CD3-CD56bright células son muy capaces de migrar a los lugares de inflamación local, donde aumentar la inflamación de la estimulación del TNF-α producción de monocitos [36]. Por lo tanto, disminución del número de CD3-CD56bright células en la sangre periférica de pacientes con enfermedades del corazón puede sugerir su tráfico a los tejidos afectados por el proceso inflamatorio, tales como las paredes de las arterias, en los que acelerar los cambios no rentables como la aterosclerosis.

También vale la pena mencionar que el descenso de las células NK la actividad citotóxica puede ser una consecuencia del efecto proinflamatorio ejercida por citoquinas. Nuestro trabajo previo mostró que las personas mayores que padecen diferentes trastornos se caracterizan por su elevado nivel de esta citoquina y, al mismo tiempo por una baja actividad NK [37]. Enfermedad coronaria se asocia con un aumento de citoquinas proinflamatorias concentrationy [38]. Por lo tanto, una inflamación que acompaña a las enfermedades del corazón puede agravar la pérdida de actividad de las células NK.

Conclusión

En resumen, nuestros datos indican que la enfermedad coronaria se asocia con un deterioro de las células NK compartimiento.

Métodos
Los pacientes

Noventa tres pacientes sometidos a primera vez que la arteria coronaria de by-pass injerto de la Clínica de cardiocirugía de la Universidad de Medicina de Gdansk fueron seleccionados.

Características básicas de los pacientes se muestra en la Tabla 1. La hipertensión se define como la presión arterial sistólica ≥ 140 mm Hg o presión arterial diastólica ≥ 90 mm Hg, o la historia del paciente de anti-hipertensivos tratamiento comprobado a la admisión. La diabetes se define como de glucosa en ayunas ≥ 126 mg / dl, no de glucosa en ayunas ≥ 200 mg / dl, o la historia del paciente de diabetes verificado al ingreso. Angiografía coronaria se realizó en todos los pacientes. Los pacientes fueron calificados de la arteria coronaria de by-pass injerto (CABG) en caso de que tenían al menos una estenosis con un diámetro de ≥ 75% en la arteria coronaria derecha (RCA) y / o izquierda-la arteria descendente anterior (LAD) y / o circunfleja izquierda arteria (CX). Cuarenta y nueve personas, de similar edad, con excluidas las enfermedades coronarias se matricularon en el estudio como un grupo de control. La enfermedad fue excluido en la base del examen físico, la falta de síntomas clínicos de las enfermedades del corazón y normal en reposo y el ejercicio relacionados con el electrocardiograma. El consentimiento informado se obtuvo de todos los participantes. El presente estudio fue aprobado por el Comité de Ética de la Universidad de Medicina de Gdańsk.

Muestreo y el aislamiento de células

Muestras de sangre venosa (10 ml) fueron recolectadas entre 9,00 y 10,00 horas aséptica en los tubos con anticoagulante (EDTA tubos de Medlab, Austria) un día antes de una cirugía.

La sangre periférica de células mononucleares (PBMC) se obtuvieron, a partir de sangre venosa, por centrifugación en Ficoll-Hypaque gradiente. El PBMC se cultivaron en medio RPMI 1640 con 5% inactivado por calor suero de ternera fetal (FCS) en una placa de plástico (Gibco, BRL Life Technologies, EE.UU.). Después de 1 h de incubación, en un ambiente humidificado contiene 5% de CO 2 a 37 ° C, no adherente linfocitos de sangre periférica (PBL) han sido recogidos.

NK citotóxica de ensayo

Actividad citotóxica de PBL se determinó en un ensayo colorimétrico basado en la medición de lactato dyhydrogenase (LDH) liberada de la actividad citosol de las dañadas las células diana K562 (humanos erythroleukemia línea celular) en el sobrenadante con el uso del "Kit de detección de citotoxicidad" (Roche Diagnostics, Alemania). El NK-tumor sensible K562 línea se cultivó en medio RPMI 1640 suplementado con 5% FCS, 100 μ g / ml estreptomicina, 100 U / ml penicilina (Sigma Chemical Co, EE.UU.), en un ambiente humidificado contiene 5 de CO 2 a 37 ° C. PBL se suspendieron RMPI 1640 en el medio suplementado con 1% FCS en la concentración de 2 × 10 5 células / ml, que era la concentración óptima de células efectoras (ABP) ha determinado en estudios experimentales, produciendo niveles óptimos de muerte (cada vez más hacia una meseta ). Los cultivos de células de 100 μ l PBL (2 × 10 5 células / ml) y 100 μ l de las células diana (2 × 10 4 células / ml) por triplicado fueron incubadas a fondo redondo placas microtiter para 4 h (efectoras de células diana ratio = 10: 1) en un ambiente humidificado contiene 5 de CO 2 a 37 ° C. Las placas fueron centrifugadas durante 10 min a 250 g, 100 μ l de los sobrenadantes fueron trasladados a fondo plano placas microtiter, y la actividad de LDH fue determinado usando el "Kit de detección de citotoxicidad" (Roche Diagnostics, Alemania). Densidad óptica se leyó a 492 nm en el lector de placas automatizado (Bio-Tek FL600, Bio-Tek Instruments, Inc Winooski, EE.UU.). LDH liberación espontánea se determinó mediante la incubación de 100 μ l de las células diana con 100 μ l de medio. La liberación máxima se determinó mediante la incubación de 100 μ l de las células diana, más de 100 μ l medio con una concentración final de 1% Tritón X-100 (Sigma Chemical Co, EE.UU.). El porcentaje de citotoxicidad NK, se calculó mediante la siguiente fórmula: NK citotoxicidad (%) = [(valor experimental - liberación espontánea) / (máximo liberación - la liberación espontánea)] × 100%

La tinción de las células NK

Las muestras de sangre venosa se aliquoted en tubos de plástico (Falcon, la empresa Becton Dickinson, EE.UU.), 100 μ l por tubo. Las células fueron teñidas con anti-CD3 (IgG2a, κ ratón PE-Cy5, Clon: HIT3a, PharMingen, Becton Dickinson Company, EE.UU.), anti anti-CD56 (IgG1, κ PE ratón, Clon: B159, PharMingen, la empresa Becton Dickinson, EE.UU.) anticuerpos humanos (20 μ g / prueba). En cada serie, isotypic adecuado control se hizo (IgG2b, κ ratón PE-Cy5, Clon: 27-35, IgG1k PE ratón, Clon: MOPC-21, PharMingen, Becton Dickinson Company, EE.UU.). Después de 30 min de incubación en la oscuridad en una RT muestras fueron fijadas mediante el Immuno-prep reactivos (Immunotech, EE.UU.) con Q-prep Inmunología de trabajo (Coulter, EE.UU.).

Culturas de la sangre periférica de células mononucleares

PBMC se obtuvieron por centrifugación en Ficoll-Hypaque gradiente y posteriormente cultivadas en el plástico de 24 placas y por triplicado, 1 × 10 6 células por pocillo, en 1 ml de RPMI con 5% FCS. Los cultivos fueron incubados con con phorbol 12-myristate 13-acetato [PMA] durante 5 horas (Sigma Chemical Co EE.UU.) y ionomycin (Sigma Chemical Co EE.UU.), tanto en la final de las concentraciones de 50 ng / ml. Dos microlitros de GolgiPlug (PharMingen, Becton Dickinson, EE.UU.) se añadieron junto con PMA y ionomycin para evitar una fuga de las citoquinas. Control de cultivos fueron incubados durante 5 horas (h) sólo con la PMA y la ionomycin

La tinción intracelular de citoquinas

El PBMC culturas se vortexed y aliquoted en 12 × 75 mm tubos de plástico (Falcon, Becton Dickinson, EE.UU.), 2 × 10 5 células por tubo. Después del lavado de células con tinción de amortiguación (PBS sin Ca 2 + y Mg 2 + con 1% inactivado por calor fetal suero de ternera y 0,09% azida sódica), las células fueron teñidas con anti-CD3 (IgG2a, κ ratón PE-Cy5, Clone : HIT3a, PharMingen, Becton Dickinson Company, EE.UU.), anti anti-CD56 (IgG1, κ PE ratón, Clon: B159, PharMingen, Becton Dickinson Company, EE.UU.) y anticuerpos humanos incubados 30 min en la oscuridad a una temperatura ambiente (RT ). Luego, las células fueron lavadas y fijadas en paraformaldehído al 4% (Sigma Chemical Co, EE.UU.) en PBS sin Ca 2 + y Mg 2 +, lavado y permeabilised utilizando 0,5 ml de saponina 0,1% (en PBS sin Ca 2 + y Mg 2 + con 1% inactivado por calor fetal suero de ternera y 0,09% azida sódica) durante 20 minutos en una RT. Luego, las células fueron lavadas y teñidas con anti IFN-γ (IgG 1, κ FITC ratón, Clon: B27, Pharmingen, BD EE.UU.) y mAbs isotipo (IgG 1, κ FITC ratón, Clon: MOPC-21, Pharmingen, BD EE.UU.) [1 μ g / prueba] y se incubaron 30 min en la oscuridad en una RT. Las muestras fueron posteriormente lavadas y fijadas en una solución de PBS que contenga 2% de paraformaldehído (Sigma Chemical Co, EE.UU.).

Adquisición y análisis de citometría de flujo de datos

Listmodes fueron adquiridos en Epics XL citómetro de flujo (Coulter, EE.UU.) y analizados utilizando Winlist, versión 5,0, los programas informáticos. Las células muertas fueron excluidos por presentar (FSC) y secundarios (SS) ángulo de luz difusa ventana. La región que contiene los linfocitos se generó sobre la base de la utilización de avanzar frente a su ángulo derecho luz dispersa. A linfocitos puerta se utilizó para medir la proporción de células NK subgrupos en la muestra. Típicamente, 10 000 eventos fueron adquiridos en esta región. El número absoluto de células se determinará multiplicando los respectivos porcentajes obtenidos por citometría de flujo por los respectivos absoluta cuenta de los informes de laboratorio clínico.

Estadísticas

Los datos fueron calculados usando el programa Statistica 6.0 (Statsoft, Polonia). Paramétricas y no paramétricas se evaluó la distribución de W Shapiro-Wilk test. El análisis se basó en la no-paramétrica estadística-U de Mann-Whitney test según lo indicado por la distribución de datos.

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

Autores de las contribuciones

ŁH llevado a cabo experimentos, análisis estadístico y redactó el manuscrito.

JM diseño y coordinación de estudio y ayudó a redactar el manuscrito.

JW participó en el análisis de citometría de flujo.

KS fue responsable de las enfermedades del corazón y los pacientes examen de selección.

PT participó en el grupo control de selección y también participó en la preparación del manuscrito.

JS consultado a los resultados clínicos.

AM consultado resultados y preparación de manuscritos.

Todos los autores leído y aprobado el manuscrito final.